Влияние мелатонина на оксидативный статус, содержание цитрата и активность аконитатгидратазы в печени крыс при токсическом гепатите

Гормон диффузной нейроэндокринной системы .елатонин играет роль регулятора многих физиологических функций: участвует в формировании : уточных биоритмов, торможении некоторых функций гипофиза, регуляции иммунных реакций, называет снотворное, анальгезирующее и седативное действие [3, 8, 15]. Имеются данные о проективном действии мелатонина при канцерогенезе [10, 18] и свободнорадикальном повреждении тканей [13, 16]. Известно, что интенсификация свободнорадикального окисления, возникающая вследствие дисбаланса между чрезмерной продукцией активных форм кислорода (АФК) и недостаточностью функционирования антиоксидантной системы (АОС), является важнейшим патогенетическим фактором в развитии ряда заболеваний, включая многие заболевания печени [1, 14]. Центральное место в неферментативном звене АОС занимает ос-токоферол. Известно, что роль синергиста а-токоферола, способного восстанавливать его хинонную форму в фенольную и таким образом реве нерировать антирадикальную активность, может выполнять цитрат [4]. Кроме того, цитрат обладает .пособностью связывать ионы Fe²⁺, являющиеся частниками реакции Фентона, в ходе которой образуется одна из наиболее реакционно-способных АФК — гидроксильный радикал [17, 19]. Имеются данные о накоплении цитрата в миокарде и мозге

‘Работа поддержана грантом программы "Университеты России" УР 07.01.004.

крыс при гипоксии [11]. Предполагается, что решающая роль в регуляции накопления цитрата принадлежит аконитатгидратазе (КФ 4.2.1.3). Аконитатгидратаза катализирует реакцию превращения цитрата в изоцитрат, и таким образом данный фермент может участвовать в регуляции уровня Fe²⁺ [5]. В некоторых работах сообщается о факте индуцируемого АФК подавления активности аконитатгидратазы, что позволяет рассматривать данный фермент в качестве чувствительной и критической мишени действия АФК в условиях окислительного стресса [6].

Целью настоящей работы явилось исследование действия мелатонина на уровень свободнорадикальных процессов, содержание а-токоферола, цитрата и активность аконитатгидратазы в норме и при экспериментальном токсическом гепатите.

Материалы и методы

В качестве объекта исследования использовали белых крыс-самцов (Rattus rattus L.) массой 150— 200 г. Животных разделили на 4 экспериментальные группы: 9 крыс 1-й (контрольной) группы содержали на стандартном режиме вивария; 9 животным 2-й группы для индуцирования токсического гепатита однократно вводили гепатотропный токсин СС1₄ в дозе 0,064 мл на 100 г массы тела после пищевой депривации животных в течение 1 сут; максимальный цитолиз гепатоцитов имел место на 3—4-е сутки [7], когда активность аланинаминотрансферазы и аспартатаминотрансферазы возрастала в 7,4 и 4,3 раза соответственно; 8 животным 3-й группе вводили мелатонин (2 мг/кг) внутрибрюшинно ежедневно в течение 3 дней в утренние часы; 8 крысам 4-й группе на следующий день после индуцирования токсического гепатита вводили мелатонин (2 мг/кг) в утренние часы в течение 3 дней. Печень извлекали у животных под наркозом после многократного перфузирования ледяным физиологическим раствором [7]. Ткань печени крыс измельчали и гомогенизировали в 4-кратном объеме охлажденного 0,1М трис-НС1-буфера (pH 7,8), содержащего 1 мМ ЭДТА, 1% р-меркаптоэта- нол. Гомогенат центрифугировали при 10 000 g 12 мин. Интенсивность свободнорадикальных процессов и общую антиоксидантную активность оценивали методом биохемилюминесценции [2]. Активность аконитатгидратазы определяли на спектрофотометре СФ 56 при 235 нм в среде, содержащей 0,05 мМ трис-НС1-буфер (pH 7,8), 4 мМ цитрат. За ферментативную единицу (ФЕ) принимали количество фермента, необходимого для превращения 1 мкмоля субстрата в минуту при 25°С. Количество цитрата определяли по методу Натель- сона [4]. Концентрацию а-токоферола определяли по методу, основанному на фотометрировании хромогенного комплексного соединения Fe²⁺ и ор- тофенотролина [9], уровень белка — по методу Лоури [12]. Достоверность различий оценивали по /-критерию Стьюдента.

В работе использовали мелатонин, цитрат фирмы "Sigma" (США), трис-НС1-буфер, ЭДТА фирмы "Reanal" (Венгрия), остальные реактивы отечественного производства марки х. ч. или ч. д. а.

Результаты и их обсуждение

При токсическом гепатите показатели биохемилюминесценции — светосумма хемилюминесценции (S) и интенсивность максимальной вспышки (I_max), отражающие интенсивность процессов свободнорадикального окисления, — возрастали в гомогенате печени в 2,2 раза (см. таблицу). Величина тангенса угла наклона кинетической кривой (tg а₂), являющаяся показателем антиокислительного потенциала, увеличивалась в 3 раза по сравнению с контролем. При введении мелатонина интактным животным происходило увеличение S и 1_юах в 1,4 раза; tg а₂ возрастал на 73%. Мелатонин на фоне развития токсического гепатита снижал S и 1_шах в 1,3 раза, а величина tg а₂ уменьшалась на 53% по сравнению со 2-й опытной группой. Полученные результаты согласуются с данными о способности мелатонина к перехвату свободных радикалов. Так, показано, что мелатонин является мощным ингибитором макромолекулярного повреждения, вызванного гидроксильным радикалом [16].

Интенсивность процессов свободнорадикального окисления в гомогенате печени

Примечание. Звездочки — достоверность различий (р < 0,05): одна — с интактными животными (1-я группа), две — с животными с экспериментальным токсическим гепатитом (2-я группа).

Содержание а-токоферола в гомогенате печени крыс с токсическим гепатитом было ниже, чем в печени контрольных животных (рис. 1). При введении мелатонина наблюдали увеличение содержания а-токоферола в печени как интактных животных, так и крыс с токсическим гепатитом. Поскольку а-токоферол является основным антиоксидантом в липидной фазе мембран, то, очевидно, возрастание его концентрации свидетельствует о положительном действии мелатонина на неферментативную АОС печени и является подтверждением гепатопротекторного действия данного гормона.

При токсическом гепатите в печени крыс происходило снижение активности аконитатгидратазы: удельная активность фермента уменьшалась в 3 раза, активность, выраженная в ФЕ на 1 г сырой массы, — в 1,6 раза по сравнению с нормой (рис. 2). При этом содержание цитрата увеличивалось в 1,3 раза (рис. 3). По-видимому, это может быть следствием того, что молекула данного фермента легко разрушается АФК, содержание которых при токси- -еском гепатите возрастает. Это приводит к накоплению цитрата, способного выполнять антиоксидантную функцию за счет хелатирования Fe²⁺. При ведении мелатонина интактным животным также наблюдали снижение активности аконитатгидрата- 1, хотя оно было выражено в значительно меньшей степени по сравнению со 2-й группой (удельная активность аконитатгидратазы снижалась в 1,6 раза). Однако уровень цитрата возрастал в 2 раза. Нельзя исключить, что это могло быть связано с изменением активности других ферментов, участвующих в метаболических превращениях цитрата, — нитратсинтазы, АТФ-цитратлиазы, карнитинацеилтрансферазы. Повышение содержания цитрата : печени под действием мелатонина также можно рассматривать как усиление антиоксидантного потенциала, так как это способствует уменьшению збразования агрессивного ОН -радикала в реакции Фентона. После введения мелатонина крысам с токсическим гепатитом удельная активность ако- нитатгидратазы возрастала в 1,4 раза, а концентрация цитрата — в 1,8 раза по сравнению с результатами, полученными во 2-й группе. По-видимому, антиоксидантное действие мелатонина снижает потребность в цитрате, а также уменьшает степень повреждения молекулы фермента свободными радикалами, что приводит к изменению активности аконитатгидратазы в сторону нормы.

Выводы

1. Введение мелатонина животным с токсическим гепатитом положительно влияет на оксидативный статус ткани печени, что проявляется в снижении интенсивности свободнорадикальных процессов и степени мобилизации АОС, оцениваемых по показателям биохемилюминесценции.
2. Введение мелатонина вызывает увеличение содержания а-токоферола в печени как интактных животных, так и крыс с токсическим гепатитом, что является подтверждением гепатопротекторного действия данного гормона.
3. Введение мелатонина интактным животным приводит к снижению активности аконитатгидратазы и повышению уровня цитрата, что можно рассматривать как усиление антиоксидантного потенциала, так как это способствует уменьшению образования ОН-радикала в реакции Фентона. Под действием мелатонина при токсическом гепатите в печени животных наблюдаются возрастание содержания цитрата и изменение активности аконитатгидратазы в сторону нормы по сравнению с крысами с токсическим гепатитом, которым не вводили гормон. Это, по-видимому, связано с меньшей степенью мобилизации АОС организма в присутствии мелатонина, способного давать антиоксидантный эффект.