Влияние метформина на выраженность окислительного стресса у пациентов с сахарным диабетом 2-го типа

Заболевания сердечно-сосудистой системы являются основной причиной смерти больных с сахарным диабетом 2-го типа (СД2) [14, 29]. Смертность от сердечно-сосудистых заболеваний больных СД2 в 3 раза выше, чем у населения в целом [13, 28]. При этом в 80% случаев причиной смерти является атеросклеротическое поражение коронарных, церебральных и периферических сосудов [16]. В целом от заболеваний, обусловленных атеросклерозом, умирает больше больных диабетом, чем от всех других причин вместе взятых [ 1 ]. Важную роль в прогрессировании атеросклеротических поражений сосудов при диабете может играть активация процессов свободнорадикального окисления, в частности образование окисленных липопротеидов низкой плотности (ЛПНП) в плазме крови, что может сопровождаться модификацией этих частиц и их усиленным поглощением моноцитами-макрофагами, которые трансформируются в пенистые клетки, участвующие в предатерогенной липидной инфильтрации стенки сосуда [3, 5].

Основным фактором, вызывающим атерогенную модификацию ЛПНП in vivo, являются карбонильные соединения —альдегиды, образующиеся при свободнорадикальном окислении липидов (подобные 4-гидроксиноненалю и малоновому диальдегиду — МДА) или при автоокислении глюкозы в условиях гипергликемии (подобные глиоксалю — G, метилглиоксалю — MG и 3-деоксиглюко- зону) [17, 19]. Эти а-оксоальдегиды являются чрезвычайно активными соединениями, способными гликировать различные белки, включая апопротеины ЛПНП [8]. Поскольку модификация ЛПНП, индуцируемая неферментным гликозилированием, может повышать их атерогенность, т. е. способность проникать в интиму сосудов и захватываться макрофагами с образованием пенистых клеток, понятно существование определенной взаимосвязи между скоростью прогрессирования атеросклероза и уровнем гипергликемии при сахарном диабете [15]. Исходя из этого, вполне оправданы попытки ограничить интенсивность свободнорадикального окисления при диабете за счет компенсации углеводного обмена, что подтверждают результаты исследования UKPDS [27].

Ранее нами было показано, что у больных СД2. имеющих уровень общего холестерина плазмы даже ниже, чем у пациентов с гиперхолестеринемией (ГХС), выраженность окислительного стресса, определяемого по содержанию окисленных липопротеидов, в 4—5 раз превышает таковую у пациентов с ИБС и ГХС [6]. В настоящем исследовании мы предприняли попытку сравнить влияние различных видов сахароснижающей терапии на выраженность окислительного стресса при СД2.

Материалы и методы

В исследование было включено 70 пациентов, страдающих СД2, из которых 40 пациентов с впервые выявленным сахарным диабетом не получали на момент включения никакой сахароснижающей терапии, остальные 30 пациентов с длительностью диабета более 5 лет получали на момент включения в исследование препараты сульфанилмочевины — ПСМ (манинил — 15 больных, диабетон — 15 больных). Клиническая характеристика пациентов приведена в табл. 1. Все больные на момент начала исследования находились в состоянии декомпенсации углеводного обмена. Компенсации углеводного обмена у пациентов с впервые выявленным сахарным диабетом достигали с помощью метформина (глюкофаж производства компании "Никомед" в суточной дозе 1500—2500 мг). У пациентов с длительностью диабета более 5 лет компенсации добивались путем коррекции дозы ПСМ либо комбинацией последних с метформином в суточной дозе 500—1000 мг. Перед началом исследования и через 2 мес после достижения удовлетворительной компенсации углеводного обмена в соответствии с критериями European Diabetes Police Group (1998) в крови пациентов проводили определение уровня гликированного гемоглобина (НЬ А_1с), содержания первичных (липогидропероксиды) и вторичных (МДА) продуктов свободно радикального окисления липидов в ЛПНП, а также активности ключевых антиоксидантных ферментов (супероксиддис- мутазы — СОД и глутатионпероксидазы — ГП) в эритроцитах. Уровень НЬ А_1с определяли на анализаторе "Bayer DCA-2000" методом латексного ингибирования иммуноагглютинации с помощью НЬ А_1с Reagent Kit фирмы "Bayer". Для выделения ЛПНП у больных натощак брали венозную кровь в при

сутствии 1 мг/мл ЭДТА в качестве антикоагулянта и антиоксиданта. Плазму подвергали двукратному центрифугированию в градиенте плотности NaBr в течение 2 ч при 42 000 об/мин в угловом роторе 50Ti при 4°С в рефрижераторной ультрацентрифуге "Beckman L-8", а затем подвергали диализу при 4°С в течение 16 ч, как описано ранее [2]. Содержание белка в ЛПНП определяли по методу Лоури, после чего ЛПНП разбавляли до 50 мкг/мл раствором, содержащим 0,154 М NaCl и 50 мМ фосфатного буфера, pH 7,4. Окисление ЛПНП инициировали при 37°С введением 30 мкМ CuSO₄, после чего через фиксированные интервалы времени измеряли накопление липогидропероксидов при 233 нм на спектрофотометре "Hitachi 220А". По результатам исследований строили кинетические кривые окисления ЛПНП, из которых определяли продолжительность лаг-фазы (период индукции окисления, пропорциональный уровню антиоксидантов в ЛПНП) [2]. Уровень липидных гидропероксидов в ЛПНП измеряли специфичным модифицированным методом с использованием Ее²⁺-ксиленоло- ранжа до и после восстановления органических гидропероксидов трифенилфосфином [4]. Содержание вторичных продуктов свободнорадикального окисления липидов (МДА) определяли по реакции с 2-тиобарбитуровой кислотой [2]. Активность эритроцитарной Си, Zn-супероксиддисмутазы определяли по ингибированию восстановления синего нитротетразолия супероксидным радикалом, определяя кинетику образования формазана на регистрирующем спектрофотометре "Hitachi-557" при 560 нм [2]. Активность Se-содержащей глутатионпероксидазы эритроцитов определяли по скорости окисления NADPH при 340 нм с гидропероксидом трет-бутила в качестве субстрата, используя химический анализатор FP-901 Labsystems Оу в кинетическом режиме работы [2]. Все использованные реагенты были получены от фирмы "Sigma". Статистическую обработку данных проводили на персональном компьютере с использованием специального статистического пакета SPSS, версия 9.0 (SPSS inc. США). Для определения достоверности различий между сравниваемыми группами использовался /-критерий Стьюдента. При анализе парных изменений (сравнение результатов до и после лечения) применялся парный критерий Стьюдента. Различия считались достоверными при р < 0,05. Все средние значения в таблицах представлены в виде М ± SD.

Таблица 1

Клиническая характеристика обследованных (М ± т)

Примечание. * — р < 0,05; ** — р < 0,001 — по сравнению с исходными данными. ИМТ — индекс массы тела.

Результаты и их обсуждение

При достижении компенсации углеводного обмена в крови больных СД2 обеих групп было выявлено достоверное снижение уровня НЬ А_1с (табл. 2). Одновременно у всех больных было обнаружено существенное уменьшение содержания как первичных (липопероксиды), так и вторичных (МДА) продуктов свободнорадикального окисления в ЛПНП плазмы крови (см. табл. 2), а также увеличение активности ключевых антиоксидантных ферментов, ответственных за утилизацию активных форм кислорода (увеличение активности су- пероксиддисмутазы) и липопероксидов (увеличение активности глутатионпероксидазы), обнаруженное нами в эритроцитах больных СД2 после компенсации углеводного обмена (см. табл. 2). Таким образом, компенсация углеводного обмена у больных СД2 сопровождается очевидным снижением выраженности проявлений окислительного стресса (см. табл. 2), что подтверждает теоретические предпосылки нашей работы.

По степени достигнутой компенсации группа пациентов с вновь выявленным диабетом, получавших метформин (глюкофаж), не отличалась значимо от пациентов, компенсированных на фоне терапии ПСМ с длительностью заболевания более 5 лет. Однако при идентичной степени компенсации углеводного обмена по снижению уровней липопероксидов плазмы крови эти группы пациентов различались в 5 раз (р < 0,001), несмотря на то что исходное содержание окси-ЛПНП было практически одинаковым (см. табл. 2), а выраженность гипер- и дислипидемии как до начала терапии, так и при достижении компенсации углеводного обмена достоверно не различалась (см. табл. 1). При этом продолжительность лаг-фазы Си²⁺-индуцируемого свободнорадикального окисления ЛПНП, изолированных от плазмы крови больных СД2, получавших метформин (глюкофаж), возросла почти в 4,5 раза (см. табл. 2), тогда как в группе пациентов, принимавших ПСМ, не выявлено достоверных изменений. Столь явное положительное действие компенсации углеводного обмена на интенсивность свободнорадикальных процессов в крови пациентов, получавших метформин, не может быть объяснено только различиями в длительности течения сахарного диабета. По нашему мнению, очевидно позитивное влияние метформина не только как эффективного антигипергликемического средства, но и как активного ангиопротектора, препятствующего развитию диабетических ангиопатий [9, 18, 21, 22, 24, 25, 27]. По данным UKPDS [27], при интенсивном лечении метформином у больных СД2 происходило 40—50% снижение коронарных событий по сравнению с пациентами, получавшими ПСМ или инсулинотерапию в интенсивном режиме, при адекватном улучшении гликемического контроля. Логично предположить, что метформин оказывает ангиопротекторное действие независимо от его сахароснижающих свойств. Подтверждением этого можно считать многочисленные экспериментальные и клинические исследования, показавшие, что метформин может ингибировать процессы гликирования независимо от антигипергликемического эффекта [18, 21, 22, 24, 25]. Наиболее интересны исследования Р. Beisswenger [9] и D. Rugguiero-Lopez [22], продемонстрировавшие способность метформина связывать а-оксалоальдеги- ды — MG и G, образующиеся при автоокислении глюкозы и, как уже упоминалось, активно инициирующие процессы неферментного гликирования.

Таблица 2

Влияние компенсации углеводного обмена на показатели окислительного стресса у больных СД2

Примечание. *■ ** — достоверно по сравнению с исходными данными; “• ” — достоверность исходной разницы между сравниваемыми группами; — достоверность разницы между сравниваемыми группами при достижении компенсации.

В исследовании in vitro было показано, что в условиях, близких к физиологическим, метформин непосредственно реагирует с MG и G, образуя стабильный продукт — триазепинон (TZP), который эскретируется с мочой (см. рисунок). Несколько исследовательских групп в последующем подтвердили эти результаты [7, 12]. Было показано, что у пациентов, получающих метформин, происходит значительное снижение содержания MG в плазме [9] и повышенное выделение TZP с мочой [23], коррелирующее с дозой препарата.

Альтернативным объяснением снижения уровня MG при применении метформина, разумеется, может быть снижение окислительного стресса за счет снижения уровня гликемии [20], что может приводить к повышению активности глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы [И] и сопровождаться снижением продукции MG [10]. Тем не менее в нашем исследовании при сравнимых показателях компенсации углеводного обмена мы получили 5- кратное снижение первичных (окси-ЛПНП) и вторичных (МДА) продуктов перекисного окисления липидов на фоне применения метформина (глюкофаж) по сравнению с ПСМ.

Таким образом, наши результаты подтверждают данные Р. Biesswenger и D. Ruggiero-Lopez о независимости ангиопротекторного и ингибирующего неферментное гликирование эффекта метформина от его антигипергликемического действия и свидетельствуют о значительно большем его влиянии на выраженность окислительного стресса по сравнению с ПСМ даже при идентичной степени гликемического контроля.