Новые возможности генотипирования в прогнозировании вероятности развития аутоиммунных заболеваний

Установление вероятности развития аутоиммунных заболеваний является одной из актуальных проблем биомедицины, что определяется как тяжестью, так и распространенностью этой группы заболеваний, имеющих выраженный генетический компонент [2]. В связи с этим сформировалось такое направление генетики, как поиск генетических маркеров предрасположенности и устойчивости к заболеваниям. Наибольшие успехи в этом направлении достигнуты в области изучения сахарного диабета 1-го типа (СД1), при котором наиболее информативными генетическими маркерами являются ассоциированные с СД1 аллели генов главного комплекса гистосовместимости — HLA [4]. Именно продукты этих маркерных HLA-генов — HLA- антигены участвуют в запуске и реализации развития аутоиммунной атаки [6]. К настоящему времени установлены HLA-специфичности — маркеры как предрасположенности, так и устойчивости к СД1 [6]. Установлены также выраженные межрасовые и межэтнические различия в уровне ассоциаций маркерных HLA-специфичностей и СД1, что отражается на уровне заболеваемости СД1 в конкретных этнических группах [ 1 ].

Задачей исследования явилось изучение роли второй HLA-специфичности, составляющей генотип совместно с маркерной HLA-специфичностью с учетом межэтнических различий.

Материалы и методы

Работа проводилась на материале исследования (образцах ДНК) представителей следующих этнических групп: 1) русские, татары, удмурты — европеоиды (общее число обследованных составило 398 больных СД1, в контрольную группу включено 850 здоровых представителей данных народностей); 2) калмыки, тувинцы, буряты — ориенты (число обследованных — 53 больных СД1, в контрольную группу вошло 389 здоровых представителей данных этнических групп). HLA-генотипирование на уровне определения специфичностей HLA-DRBlnpoBo- дили с использованием сиквенс-специфических праймеров, или методом SSP (sequencespecific primers). В исследовании определяли следующие HLA-DRB1-специфичности: DRBl*01, DRB1*O2, DRBl*03, DRB1*O4, DRB*05, DRBl*06, DRB1*O7, DRBl*08, DRBl*09, DRBl*10.

К положительно ассоциированным с СД1 относили специфичности DRBl*01,DRBl*03 DRB1*O4, DRBl*08, DRB1*O9, DRBl*10, к нейтральным или отрицательно ассоциированным — специфичности DRB1*O2, DRB*05, DRB1*O6, DRB1*O7 [9]. Уровень ассоциаций СД1 и HLA-специфичностей оценивали по значению относительного риска (ОР), показателя, абсолютное значение которого указывает, во сколько раз у лица, несущего в генотипе конкретную специфичность, выше вероятность заболевания по отношению к тем, у кого данная специфичность отсутствует. Все обследованные были разделены на 3 группы: 1 -я группа (+/+) — лица, в генотипе которых обе специфичности, входящие в HLA-DRB 1-генотип, имели положительную ассоциацию с СД1; 2-я группа (+/-) — лица, в генотипе которых лишь одна DRB1-специфичность была положительно ассоциирована с СД 1, в то время как вторая была нейтральна или отрицательно (протек- тивно) ассоциирована с СД1; 3-я группа (-/-) — лица, в генотипе которых обе DRB1-специфичности были нейтрально или протективно ассоциированы сСД1.

Результаты и их обсуждение

Приведенные на рис. 1 данные свидетельствуют о том, что из трех групп сравнения показатель относительного риска имел положительное значение только в 1-й группе. Из рис. 1 также видно, что значения ОР были выше в группах, относящихся к европеоидной расе (ОР = 9,2), по сравнению с группой ориентов (ОР = 3,2). Как и ожидалось, уровень ОР, свидетельствующий об отсутствии предрасположенности к СД1 (значения < 1), был зарегистрирован в 3-й группе. Значения ОР для европеоидов и ориентов составили 0,06 и 0,4 соответственно. Неожиданными, на первый взгляд, оказались данные, полученные во 2-й группе, в которой значения OP < 1 были установлены как у ориентов, так и у европеоидов — 0,53 и 0,9 соответственно.

Эти данные, на наш взгляд, свидетельствуют в пользу сочетанного участия различных HLA-cne- цифичностей, входящих в генотип и положительно ассоциированных с СД1, в реализации генетической предрасположенности к заболеванию, а по сути дела и в реализации самого аутоиммунного процесса, лежащего в основе СД1. Иными словами, проявляется "эффект необходимости" участия в этом процессе второй специфичности, входящей в HLA-DRBl-генотип, для запуска и развития СД1 [5]. Разумеется, в дальнейшем целесообразно провести подобный анализ и на уровне отдельных аллелей DRB1, для части которых, в первую очередь входящих в специфичность DRBl*04, уже хорошо установлено наличие как положительных, так и отрицательных ассоциаций с СД1. По-видимому, в дальнейшем также целесообразным явится проведение аналогичного исследования и в отношении аллелей генов HLA-DQA1 и HLA-DQB1, которые, несмотря на выраженную генетическую связь с HLA-DRB1-генами, также могут вносить самостоятельный вклад в реализацию генетической предрасположенности к СД1. Об этом, в частности, может свидетельствовать тот факт, что HLA-моле- кулы, кодируемые генами DQA1 и DQB1, обладают индивидуальными пептид связывающими сайтами, отличающимися от пептидсвязывающих сайтов молекул HLA-DRB1 [3, 8].

Представленные в настоящей работе данные свидетельствует о том, что при разработке подходов к пептидной терапии СД1, как и других аутоиммунных заболеваний, целесообразно создание широкой "библиотеки" искусственных блокирующих пептидов [7]. В этом случае стало бы возможным блокировать участие в развитии СД1 различных "диабетогенных" эпитопов молекул, составляющих HLA-генотип. На рис. 2 схематично представлен механизм такого рода блокировки. Изображены 3 варианта молекул HLA-DRB1, несущих "диабетогенные" эпитопы. Центральный вариант — молекула, кодируемая аллельным вариантом HLA- DR1*O4O1, представляющая "диабетогенный" эпитоп, результатом чего является развитие аутоиммунной реакции. Правый вариант — та же молекула, ее сайт, ответственный за представление "диабетогенного" пептида, предварительно заблокирован "измененным" искусственным пептидом, способным связываться с этим сайтом, что предотвращает взаимодействие этого сайта с "диабетогенным" пептидом. Левый вариант — иная молекула HLA-DRB 1*0404, и с ее диабетогенным сайтом не может взаимодействовать тот же пептид, который взаимодействует с молекулой HLA-DRB 1*040. В связи с этим для блокировки этого сайта необходимо создание и использование иного блокирующего "измененного" пептида. Таким образом, становится очевидной необходимость создания "библиотеки" блокирующих пептидов для всех "диабетогенных" молекул HLA. Такое решение проблемы полностью соответствует современной тенденции в разработке индивидуальных лекарственных средств.

С точки зрения клинической диабетологии и клиники аутоиммунных заболеваний в целом, на наш взгляд, несомненный интерес представляет возможность установления индивидуального риска развития заболевания, открывающаяся на основании анализа полного HLA-DRB 1-генотипа. Сопоставляя присутствие в нем "диабетогенных", нейтральных и протективных HLA-DRB 1-специфичностей, можно прийти к выводу о наличии или отсутствии у данного пациента, в том числе из членов семьи со случаями диабета, повышенной предрасположенности к развитию заболевания.

Заключение

Подобный подход открывает принципиальную возможность установления индивидуального риска развития СД1. Разумеется, дальнейшие исследования в области иммуногенетики СД1 могут резко повысить эффективность этого подхода. Тот уровень (HLA-DRB 1-генотипирование), на котором удалось установить такую возможность, уже сегодня позволяет проводить подобного рода оценку не только в специализированных научных центрах, но и в любом практическом учреждении, имеющем обычную ПЦР- лабораторию.