Семейный вариант нефрогенного несахарного диабета с частично сохранной концентрационной функцией почек, обусловленный гомозиготной мутацией D150E в гене аквапорина-2 (AQP2)

Нефрогенный несахарный диабет (ННД) характеризуется неспособностью почек концентрировать мочу в ответ на действие вазопрессина. Он бывает врожденным или приобретенным. Причинами приобретенного ННД могут быть гипокалиемия, гиперкальциемия, лечение препаратами лития, обструкция мочевыводящих путей, а также инфекционное, сосудистое и любое другое поражение почек, приводящее к нарушению их концентрационной функции [16].

Врожденный ННД встречается значительно реже и имеет генетическую природу. Примерно в 90% случаев он обусловлен дефектами рецептора к вазопрессину (V₂) и имеет Х-сцепленный тип наследования. В настоящее время описано больше 180 мутаций гена AVPR2, кодирующего вазопрессиновый рецептор. В остальных случаях заболевание наследуется аутосомно-рецессивно (9%) или аутосомно-доминантно (1%) и обусловлено мутациями гена AQP2, кодирующего регулируемый вазопрессином водный канал собирательных трубочек почек [2, 8, 16]. К настоящему времени описано 36 мутаций гена AQP2.

Кроме того, различают полную и частичную формы заболевания (с полной и частичной потерей чувствительности к вазопрессину). Последнюю обычно бывает очень трудно отличить от нервной полидипсии, возникающей в результате нарушения центра жажды.

Мы описываем 2 сибсов с врожденным ННД с частичной резистентностью к вазопрессину, обусловленным мутацией гена AQP2.

Материалы и методы

Клиническое описание случаев. Нами обследованы брат с сестрой, рожденные от близкородственного брака (рис. 1). Мальчик — от 1-й беременности, роды в срок, протекали без осложнений. Раннее развитие без особенностей. Часто болел ОРВИ. С первых месяцев жизни отмечались жажда, полиурия, повышенная утомляемость, никтурия. В возрасте 3 лет по месту жительства ему был поставлен диагноз несахарный диабет. С этого времени мальчик принимал минирин в дозе 0,1—0,3 мг/сут без особого эффекта. Со слов матери, реакция была редкой и незначительной. Временами он по 2—4 ч обходился без воды, а мог за 1 ч выпить 1 — 1,5 л. При обращении к нам в возрасте 9,5 года его суточный диурез варьировал от 6 до 10 л/сут (7—12 мл/кг/ч). Мальчик не отставал ни в росте, ни в психомоторном развитии (рост 135,7см, SDS роста = = +0,15, масса тела 35 кг).

Девочка обследована нами уже после установления диагноза у ее брата. У нее также с первых дней жизни отмечались жажда, нарушения аппетита. В возрасте с 3 до 9 мес наблюдались необъяснимые подъемы температуры. Часто болела ОРЗ (до 6—7 раз в год). Ребенок капризный, раздражительный. На момент обследования в возрасте 2 лет суточный диурез составлял до 2—3 л/сут. Физическое развитие соответствовало возрасту (рост 90,5 см, SDS роста = +1,23, масса тела 13,4 кг).

Методы. У обоих детей проводились неоднократное исследование водно-электролитного баланса с определением количества выпитой и выделенной жидкости, осмоляльности сыворотки крови и мочи, а также определение относительной плотности мочи и сывороточных концентраций электролитов. Водно-электролитный баланс исследовали при свободном режиме приема жидкости, а также на фоне пробы с лишением жидкости.

dDAVP-mecm выполнен нами в 2 вариантах: в 1-м (2-часовом) минирин давали per os в дозе 0,1 мг, при 2-м (4-часовом) вводили интраназально в дозе 0,2 мг. За 30 мин до введения минирина и далее каждые 30 мин собирали образцы мочи и крови, измеряли АД и пульс. В каждой полученной порции мочи определяли ее количество, относительную плотность, содержание Na⁺ и К⁺. Образцы плазмы собирали для оценки осмоляльности, содержания Na⁺, К⁺, креатинина, а также фактора VIII и фактора Виллебранда. Осмоляльность мочи и плазмы крови измеряли с помощью криосмомет- ра. Для определения факторов кровь собирали в отдельные пробирки с цитратом, центрифугировали немедленно после получения и замораживали. Содержание факторов определяли на автоматическом коагулометре СА-1500 ("Sysmex", Япония). Концентрацию фактора IX определяли при помощи клоттинг-теста (одностадийным методом) с использованием фактор IX дефицитной плазмы. Концентрация фактора Виллебранда выявляли им- муноферментным методом с использованием набора для определения фактора Виллебранда.

Молекулярно-генетические исследования. Образцы крови для генетического исследования были взяты у обоих сибсов и у матери.

Геномную ДНК выделяли из периферических лейкоцитов с использованием стандартных методов. С помощью ПЦР амплифицировали 2 фрагмента геномной ДНК, включающие экзоны 1—4 гена AQP2 и примыкающие к ним участки интронов: фрагмент Е1 (536 п.н., экзон 1) и фрагмент Е2—4 (1720 п.н., экзоны 2—4) (рис. 2). После электрофореза в 1% агарозном геле продукты ПЦР выделяли и очищали с использованием набора MinElute PCR Purification Kit ("Qiagen"), а затем секве- нировали на автоматическом секвенаторе ABI PRISM Model 3100 ("Applied Biosystems", США). Секвенирование ДНК проводили в Межинститутском центре коллективного пользования "ГЕНОМ" ИМБ РАН (http://www.genome-centre.narod.ru/), организованном при поддержке РФФИ (грант №00-04-55000).

При проведении ПЦР и последующем секвенировании использовали следующие олигонуклеотиды (см. рис. 2):

AQ2_1F: 5'-GCC TTG AGA AAG AGA GCG ATA G-3',

AQ2_1R: 5'-CAG AGC CCA ТСС CTC CCA TCT C-3',

AQ2_2F: 5'-CGT CTG GCA AGC CCA GGT GTT C-3',

AQ2_3F: 5'-CCTTTA GGC TGA GGT CAA G-3',

AQ2_4R: 5'-CAC GTC CAG GAA GCA GCT ACT C-3'.

Результаты

Данные лабораторных исследований. В анализе суточной мочи по Зимницкому у мальчика неизменно наблюдалась гипоизостенурия (с максимальным удельным весом мочи не более 1005— 1006). Осмоляльность мочи во всех порциях была низкой и колебалась в пределах от 92 до 253 мосмоль/кг (рис. 3). У девочки удельный вес мочи во всех порциях был равен 1000.

Таблица 1

Проба с лишением жидкости у мальчика

У мальчика при проведении пробы с лишением жидкости осмоляльность мочи возросла от 160 до 614 мосмоль/кг (с одновременным увеличением удельного веса до 1012—1013), тогда как осмоляльность плазмы существенно не менялась и варьировала в пределах от 229 до 252 мосмоль/кг. Содержание Na⁺ в плазме было в пределах нормы, хотя и было ближе к верхней границе (колебалось от 135,6 до 144,2 ммоль/л). Содержание К⁺ в плазме также было в норме (от 3,89 до 5,03 ммоль/л; данные не представлены).

Таблица 2

При повторной пробе через 6 мес осмоляльность мочи увеличивалась с 339 до 448 мосмоль/кг (с увеличением удельного веса до 1009), а осмоляльность плазмы колебалась от 282 до 352 мосмоль/кг. Уровень Na⁺ плазмы не изменился, но появилась тенденция к гипокалиемии (табл. 1).

Данные лабораторного исследования девочки представлены в табл. 2. При лишении жидкости она также, как и брат, могла частично концентрировать мочу.

Таблица 3

После dDAVP-теста (минирин 0,1 мг) per os ни осмоляльность, ни удельный вес мочи практически не менялись (данные не представлены).

При интраназальном введении минирина наблюдалось увеличение содержания факторов свертывания (фактор VIII повысился в 1,3 раза, а фактор Виллебранда — в 1,5 раза). При этом также возрастала осмоляльность мочи (до 0,434 мосмоль/кг) и плазмы крови с 275 до 289 мосмоль/кг (рис. 4, табл. 3).

Молекулярно-генетический анализ гена AQP2 у обоих детей выявил гомозиготную миссенс-мута- цию в экзоне 2, приводящую к замене аспарагиновой кислоты на глутаминовую в позиции 150 (D150E) во второй внутриклеточной петле аквапорина-2 (рис. 5). Их мать, у которой не было клиники ННД, оказалась гетерозиготной по этой мутации. Оценка функции белка нами не проводилась, но аналогичная мутация, экспрессируемая на ооцитах лягушки Xenopus laevis, приводит к нарушению проницаемости для воды в 30 раз (D. Bichet), доказывая тем самым значимость данной аминокислотной замены в патогенезе ННД у обследованных нами пациентов.

Обсуждение

ННД — редкое наследственное заболевание, обусловленное полной или частичной резистентностью почек к эндогенному вазопрессину.

Вазопрессин, связываясь с рецептором V₂R, расположенным на базолатеральной мембране клеток собирательных трубочек, через цАМФ и протеин- киназу А (РКА), стимулирует встраивание в апикальную мембрану внутриклеточных везикул, содержащих AQP2, что приводит к повышению проницаемости этой мембраны для воды. При патологии рецептора V2R (мутации AVPR2) или дефекте аквапорина-2 (мутации AQP2) нарушается реабсорбция воды в дистальном отделе нефрона и развивается ННД [2, 16].

Отличить эти 2 формы можно с помощью экзогенного введения 10—40 мкг (0,3 мкг/кг) дезамино-8- D-аргинин-вазопрессина per os, внутривенно или ин- галяционно (dDAVP-тест). Метод основан на том, что рецептор к вазопрессину V₂R экспрессируется не только в почках, но также в клетках эндотелия сосудов. Стимуляция рецептора вазопрессином не только способствует активации аквапорина-2 и соответственно концентрированию мочи, но и повышает в плазме крови уровни факторов VIII, Виллебранда и тканевого активатора плазминогена. Этого не наблюдается при мутациях рецептора V₂R.

В нашем случае при dDAVP-тесте увеличивалась концентрация факторов свертывания, что указывает на дефект AQP2, а не рецептора V₂R.

При приеме per os 0,1 мг минирина (в отличие от интраназального) ни осмоляльность, ни удельный вес мочи практически не менялись, что говорит о резистентности к вазопрессину, т. е. о ННД.

Увеличение осмоляльности мочи при интраназальном введении 0,2 мг минирина в ходе dDAVP-теста, вероятно, можно объяснить не ответом на препарат, а тем, что во время исследования ребенок не получал жидкости. В пользу этого говорит сходное изменение осмоляльности на пробе с лишением жидкости. Вторая возможная причина заключается в том, что резистентность к вазопрессину частич- на и доза минирина была в 2 раза больше.

Обнаружение мутации гена AQP2 позволило полностью подтвердить диагноз.

Ген AQP2 находится на 12ql3, состоит из 4 экзонов и кодирует вазопрессинрегулируемый водный канал, расположенный на апикальной мембране клеток собирательных трубочек почек. Мутации этого гена вызывают аутосомно-рецессивную или аутосомно-доминантную формы ННД [1, 3—7, 9—15, 17—19]. В настоящее время описано 36 мутаций — 24 миссенс, 2 нонсенс, 2 сплайсинг, 7 микроделеций и 1 микровставка (табл. 4, рис. 6). Белок аквапорин-2 состоит из N-концевой части трансмембранной области (включающей 6 доменов — ТМ1, ТМ2, ТМЗ, ТМ4, ТМ5, ТМ6), внеклеточной и внутриклеточной областей, формирующих внеклеточные (А, С и Е) и внутриклеточные петли (В и D), а также С-концевой части. Интересно, что мутации С-конца аквапорина-2 вызывают аутосомно-доминантную форму ННД [14].

В нашем случае у обоих детей гомозиготная миссенс-мутация (замена Т > А) в экзоне 2 привела к замещению аспарагиновой кислоты глутаминовой в позиции 150 (D150E) во второй внутриклеточной петле аквапорина-2. Аналогичная мутация в сочетании с другой миссенс-мутацией (G196D) была выявлена у пациента из Канады с тяжелой формой ННД (D. Bichet). Мутантный белок AQP2- G196D полностью не способен к транспорту воды, а у мутантного белка AQP2-D150E эта способность снижена примерно в 30 раз. Способность почек концентрировать мочу при сочетании этих 2 мутаций сильно нарушена. При наличии лишь 1 мутации D150E в гомозиготном состоянии концентрационная функция почек частично сохранена и, таким образом, клиника ННД более мягкая.

Заключение

Мы обнаружили мутацию D150E в гене AQP2 у 2 сибсов с ННД и частично сохраненной концентрационной функцией почек. Для диагностики этого заболевания помимо рутинных методов (анализ суточной мочи по Зимницкому, проба с лишением жидкости) нами проводился dDAVP-тест с определением реакции факторов свертывания на пероральное и интраназальное введение минирина, а также молекулярно-генетический анализ гена AQP2. Данное наблюдение расширяет наши представления об этиопатогенезе ННД.