Экскреция инсулиноподобного фактора роста 1 и фактора роста эндотелия сосудов с мочой у больных сахарным диабетом 1-го типа с нефропатиeй

Диабетическая нефропатия (ДН) — одно из наиболее частых и прогностически неблагоприятных осложнений сахарного диабета (СД), в основе которого лежит процесс склерозирования почечной ткани. В настоящее время не вызывает сомнений, что гипергликемия является главным патогенетическим фактором, запускающим процесс склерозирования клубочков и интерстиция почек при СД. Ее эффект реализуется через изменение экспрессии ряда цитокинов и факторов роста, под контролем которых находится синтетическая функция клубочковых и канальцевых клеток, аккумуляция и распад компонентов межклеточного матрикса (коллагена, гликозаминогликанов, фибронектина и др.) [1, 2]. В последнее время большой интерес исследователей вызывает роль инсулиноподобного фактора роста 1 (ИФР-1) и фактора роста сосудистого эндотелия (ФРЭС) в формировании ДН.

ИФР-1 — одноцепочечный полипептид с мол. массой 7,66 кД, аминокислотная последовательность которого высокогомологична С-пептиду и инсулину. Синтез ИФР-1 находится под контролем соматотропного гормона (СТГ), при этом ИФР-1 опосредует ростстимулирующее действие СТГ. В почечных клубочках ИФР-1 вырабатывается в ме- зангиоцитах [8]. ИФР-1 важен для процесса эмбрионального развития почек, гипертрофии и регенерации этого органа, под его контролем находится синтетическая функция почечных клеток, процессы клубочковой фильтрации и канальцевой реабсорбции [22].

Важнейшую роль в межклеточных кооперациях в почках играет ФРЭС. Описано несколько молекулярных разновидностей данного, фактора, включая ФРЭС-А, В, С, D. В настоящее время наиболее изучен ФРЭС-А, представляющий собой гликопротеид, секретируемый как гомодимер с мол. массой 45 кД. Способность вырабатывать ФРЭС присуща большинству типов клеток, но не самим эн- дотелиоцитам. Основными продуцентами ФРЭС в клубочках почек человека являются подоциты, а комплексы ФРЭС—рецептор обнаруживаются главным образом в эндотелии [12]. В функции ФРЭС входит регуляция пролиферативной активности и дифференцировки эндотелиальных клеток, проницаемости микрососудов, ангиогенеза и обмена межклеточного матрикса [24].

Важная роль ИФР-1 и ФРЭС в физиологии почек, в частности в регуляции межклеточных и кле- точно-матриксных взаимодействий, дает основания предполагать, что определение экскреции с мочой указанных факторов может являться ценным тестом для ранней диагностики и мониторирования течения ДН. Данные литературы об изменениях мочевой экскреции ИРФ-1 и ФРЭС у больных СД крайне ограничены [4, 6, 10]. Не исследована взаимосвязь экскреции ИФР-1 и ФРЭС со структурными и функциональными изменениями в почках на разных стадиях ДН.

С учетом этого, целью работы явилось изучение мочевой экскреции ИФР-1 и ФРЭС у больных СД 1-го типа с различными стадиями ДН в сопоставлении с изменениями структуры, функции почек и качеством контроля гликемии.

Материалы и методы

Обследовано 57 пациентов (24 мужчины и 33 женщины) в возрасте от 16 до 55 лет (медиана 30 лет), с длительностью заболевания от 1 мес до 41 года (медиана 6 лет). В исследование не включались больные с кетоацидозом, патологией почек недиабетического генеза, обострением сопутствующих заболеваний. Больные были разделены на 3 группы: с нормальной альбуминурией (22 человека, 1-я группа), с микроальбуминурией (23 человека, 2-я группа), с протеинурией (12 больных, 3-я группа). У 3 пациентов с протеинурией выявлен нефротический синдром, у 8 — снижение клиренса креатинина. Клинико-лабораторная характеристика групп представлена в табл. 1, демонстрирующей, что пациенты с выраженной нефропатией в целом были старше, имели большую длительность СД, худшие показатели гликемического контроля, более высокий уровень креатинина и меньшую скорость клубочковой фильтрации (СКФ).

Контрольную группу составили 10 здоровых лиц (6 мужчин и 4 женщины) в возрасте от 18 до 55 лет (средний возраст 28,8 ± 9,5 года).

Содержания ИФР-1 исследовали в утренней порции мочи методом усиленной ферментной хемолюминесценции на автоматизированном анализаторе "Immulite One" (фирма DPC, США), используя наборы фирмы—производителя прибора. Исследование содержания ФРЭС (точнее, изоформы ФРЭС-А) проводили в утренней порции мочи методом иммуноферментного анализа с помощью коммерческих наборов фирмы "Bender MedSystems" (Австрия) с использованием планшеточного ридера BioRad 680 (фирма "BioRad", США) и программного обеспечения "Zemfira". Результаты определения ИФР-1 и ФРЭС приводили к величине экскретируемого креатинина. Исследования проведены в гормональной лаборатории (зав. — канд. мед. наук В. В. Романов) МЦ "Лабораторная диагностика".

Морфологическое исследование биоптатов почек выполнено у 18 больных с ранними стадиями ДН, в том числе у 9 с нормоальбуминурией и у 9 с микроальбуминурией. Нефробиопсия проводилась с целью ранней и дифференциальной диагностики поражения почек у пациентов с факторами риска ДН: при большой длительности СД, неудовлетворительном контроле гликемии, наличии диабетической ретинопатии и/или артериальной гипертензии. Процедура проводилась под ультразвуковым контролем в лаборатории ультразвуковой диагностики (зав. А. В. Сасин) Государственной новосибирской областной клинической больницы. Больные давали письменное информированное согласие на проведение биопсии.

Выраженность изменений в почках оценивали с помощью световой и электронной микроскопии. Срезы для световой микроскопии окрашивали гематоксилином и эозином, ШИК-реакцией, по ван Ги- зону. Относительный объем мезангия определяли с помощью окулярной сетки на 289 точек (Г. Г. Автандилов, 1990). Ультратонкие срезы толщиной 35— 45 нм изучали в электронном микроскопе JEM 1010. Морфометрию структурных элементов нефрона проводили при увеличении в 38 000 раз. Определяли толщину клубочковой и канальцевой базальной мембраны (БМ), а также количество малых отростков подоцитов на 7 мкм БМ. Электронно-микроскопическое исследование почек выполнено в лаборатории ультраструктурных исследований (зав. — проф. Н. П. Бгатова) НИИ клинической и экспериментальной лимфологии СО РАМН.

Протокол исследования одобрен этическим комитетом Новосибирского государственного медицинского университета (протокол заседания № 1/11 от 16.11.05 г.).

Статистическая обработка проведена с использованием пакета Statistica 6.0. Учитывая, что распределение большинства изученных признаков было отличным от нормального, применяли методы непараметрической статистики. Межгрупповые различия оценивали с помощью критерия Манна- Уитни и ANOVA Краскела—Уоллиса. Взаимосвязь признаков изучали с помощью рангового корреляционного анализа Спирмена. Критический уровень значимости при проверке статистических гипотез принимали равным 0,05. Данные представлены как медианы, 25-й и 75-й перцентили.

Таблица 1

Характеристика групп больных СД 1-го типа с разными стадиями ДН

Примечание. Данные представлены как медианы (25-й; 75-й перцентили); звездочки — достоверные (/> < 0,05) различия: одна — с 1-й группой больных, две — с 1-й и со 2-й группами.

Таблица 2

Мочевая экскреция ИФР-1 (в пг/мкмоль) и ФРЭС (в нг/ мкмоль) у больных СД 1-го типа с разными стадиями ДН

Примечание. Звездочки — достоверные (р < 0,05) различия: одна — с контролем и 1-й группой больных, две — с контролем. 1-й и 2-й группами.

Результаты

Экскреция ИФР-1 и ФРЭС на разных стадиях ДН. Как видно из табл. 2, экскреция ИФР-1 и ФРЭС возрастала по мере увеличения выраженности ДН. У пациентов с нормоальбуминурией содержание в моче обоих факторов роста не отличалось от контроля. У больных с микроальбуминурией экскреция ИФР-1 и ФРЭС была умеренно повышена по сравнению со здоровыми лицами (р = 0,004 и р = 0,06 соответственно) и с пациентами с нормальной ЭАМ (в обоих случаях р = 0,04). Значительное повышение показателей выявлено у больных с протеинурией: медиана экскреции ИФР-1 в данной группе превышала контроль в 3,6 раза (р = 0,00008), медиана экскреции ФРЭС — в 3,1 раза (р = 0,02). Содержание ИФР-1 в 3-й группе было достоверно выше, чем в 1-й и 2-й группах больных (д = 0,000005 и р = 0,00006 соответственно). Достоверные различия по уровню ФРЭС имелись только между 1-й и 3-й группами (р = 0,02).

При ранговом корреляционном анализе выявлены значимые взаимосвязи между экскрецией ИФР-1 и уровнем креатинина (г= 0,33, р = 0,01), величиной СКФ (г = -0,43, р = 0,002) и суточной протеинурии (г = 0,39, р = 0,003). Экскреция ФРЭС с этими показателями не коррелировала (г =0,13, /7 = 0,35; г =-0,14, р = 0,03; г = 0,03, р = 0,84 соответственно).

Повышение экскреции ростовых факторов оказалось связанным с выраженностью эритропоэтин- зависимой ("почечной") анемии. Оба фактора обратно коррелировали с уровнем гемоглобина (ИФР: г =-0,41, р = 0,001; ФРЭС: г =-0,27, р = 0,04) и числом эритроцитов (ИФР: г = -0,42, р = 0,001; ФРЭС: г = -0,26, р = 0,05).

Взаимосвязь экскреции ИФР-1 и ФРЭС с ранними морфологическими изменениями в почках. При исследовании биоптатов почек у больных СД с нормо- и микроальбуминурией зафиксированы изменения, характерные для начальных стадий ДН: гипертрофия клубочков, очаговое расширение мезангия, увеличение просвета и утолщение стенок капиллярных петель, утолщение клубочковой и канальцевой БМ, расширение и частичное слияние малых отростков подоцитов, начальные этапы склероза интерстиция и артериол. Средняя толщина гломерулярной БМ составила 530 (440; 650)' нм, толщина канальцевой БМ — 740 (710; 880) нм, количество малых отростков подоцитов — 9,3 (8,2; 11,1) на 7 мкм толщины гломерулярной БМ, отношение объема мезангия к объему клубочков — 23 (20,1; 25,4)%. Как видно из табл. 3, экскреция исследованных факторов роста коррелировала с большинством указанных морфологических параметров, отражающих выраженность ранних стадий ДН.

Взаимосвязь экскреции ИФР-1 и ФРЭС с гликемическим контролем. Содержание ИФР-1 слабо коррелировало с уровнем гликемии натощак (г = 0,29, р = 0,03) и с постпрандиальной гликемией (г = 0,27, р = 0,04). Более тесная взаимосвязь выявлена с НЬА_1С (г =0,47, /7 = 0,001). Экскреция ФРЭС была ассоциирована с уровнем гликемии натощак (г = 0,36, р = 0,005), но не показала связи с постпрандиальной гликемией (г = 0,20, р = 0,14) и НЬА_1С (г = 0,02, р = 0,89).

Наиболее высокий уровень ИФР-1 наблюдался у больных с резкими колебаниями гликемии в течение суток: медиана экскреции ИФР-1 в данной подгруппе (п = 10) составила 7,53 пг/мкмоль креатинина, 25-й и 75-й перцентили — 6,12 и 12,6 пг/ мкмоль соответственно. В отношении ФРЭС подобной закономерности не выявлено.

Между ИФР-1 и ФРЭС прослеживалась умеренная корреляционная взаимосвязь (/• = 0,55, р = 0,00001).

Таблица 3

Корреляции мочевой экскреции ИФР-1 и ФРЭС со структурными параметрами почек у больных СД 1-го типа с нормо- и микроальбуминурией

Примечание, г — коэффициенты ранговой корреляции Спирмена, р — достоверность коэффициентов корреляции.

'В скобках приводятся 25-й и 75-й перцентили.

Обсуждение

Проведенное исследование показало нарастание мочевой экскреции ИФР-1 и ФРЭС у больных СД 1-го типа по мере увеличения выраженности ДН. Вероятно, это отражает увеличение продукции данных медиаторов в почках. Возрастание почечной экспрессии ИФР-1 [16, 20] и ФРЭС [17, 18] выявлено у животных с экспериментальным диабетом. Усиление почечного синтеза ФРЭС обнаружено и у пациентов с ДН [4, 12].

Наиболее вероятным фактором, активирующим синтез ИФР-1 и ФРЭС при СД, является гипергликемия. Проведенные нами исследования показали взаимосвязь между качеством гликемического контроля и экскрецией этих медиаторов с мочой. Это соответствует результатам экспериментов, свидетельствующих, что избыток глюкозы активирует продукцию ИФР-1 и ФРЭС в почечных клетках. In vitro показано, что высокий уровень глюкозы усиливает экспрессию гена ИФР-1 в мезангиоцитах [19], а также синтез ФРЭС в подоцитах [13], мезангиоцитах [4, 17] и в эпителиоцитах канальцев [14]. Наиболее высокий уровень экскреции ИФР-1 зафиксирован нами у пациентов с резкими колебаниями гликемии в течение суток. Данную взаимосвязь можно объяснить тем, что синтез ИФР-1 контролируется СТГ, а продукция последнего возрастает при резких колебаниях гликемии. На стадии клинически выраженной ДН гиперпродукцию ростовых факторов может усиливать анемия и связанная с ней хроническая гипоксия почек. В экспериментах показано, что гипоксия обладает стимулирующим эффектом на синтез ФРЭС. Подобным эффектом обладает ИФР-1 [21].

Повышение синтеза ИФР-1 и ФРЭС может играть важную роль в развитии ДН. Обсуждается несколько путей вовлечения ИФР-1 в патогенез диабетического поражения почек. Установлено, что ИФР-1 повышает продукцию коллагена IV типа и других компонентов межклеточного матрикса [23] и снижает синтез коллагенолитических ферментов [15] в мезангиальных клетках. Тем самым он может способствовать аккумуляции коллагена в мезангии. ИФР-1 вызывает аккумуляцию липидов в мезангиоцитах, что нарушает их сократительные свойства и способствует превращению в "пенистые" клетки [3]. На ранних стадиях нефропатии указанный фактор способствует развитию гипертрофии клубочков [15], а также гиперфильтрации [10]. ИФР-1 оказывает антинатрийуретический эффект [10], что связано с его способностью повышать реабсорбцию натрия в дистальных канальцах [25]. Это свойство ИФР-1 может способствовать задержке натрия и воды у пациентов с ДН.

Роль ФРЭС в развитии ДН связана со способностью данного фактора активировать диацилг- лицеролзависимые изоформы протеинкиназы С — фермента, через который гипергликемия оказывает стимулирующий эффект на синтез межклеточного матрикса [26]. ФРЭС повышает синтез коллагена IV типа в подоцитах [5], стимулирует пролиферацию мезангиальных клеток [18], увеличивает проницаемость клубочковых капилляров и альбуминурию, а также вызывает воспалительные изменения в клубочках, способствуя привлечению в них мононуклеаров [24]. Значение ФРЭС для развития ДН доказано в экспериментах на животных. Показано, что введение антител к ФРЭС мышам линии db/db с СД тормозит развитие гипертрофии клубочков, препятствует утолщению БМ, росту альбуминурии и повышению уровня креатинина [8]. У крыс со стрептозотоциновым диабетом антитела к ФРЭС уменьшали гипертрофию клубочков, гиперфильтрацию и альбуминурию [7].

Итак, активацию продукции ИФР-1 и ФРЭС в почках при СД можно рассматривать как одно из связующих патогенетических звеньев между гипергликемией и нефросклерозом.

Исследование экскреции ростовых факторов с мочой может использоваться в целях ранней диагностики ДН. Это доказывают обнаруженные нами взаимосвязи экскреции ИФР-1 и ФРЭС с морфологическими параметрами, отражающими степень изменений в почках на ранних стадиях ДН (толщина клубочковой и канальцевой БМ, объем мезангия, количество малых отростков подоцитов). Вероятно, определение экскреции факторов роста может быть прогностическим тестом, позволяющим оценить риск развития нефросклероза. Справедливость данного предположения нуждается в проверке в проспективных исследованиях.

Обнаруженная взаимосвязь экскреции ростовых факторов с параметрами гликемического контроля еще раз подтверждает важность достижения нор- могликемии в профилактике ДН. Установление роли фиброгенных факторов роста в патогенезе ДН позволяет наметить ряд перспективных подходов к лечению данного осложнения. Они заключаются в использовании антител к факторам роста, антагонистов их рецепторов, "нокаутировании" генов ростовых факторов, применении ингибиторов ангиогенеза [19]. Указанные подходы положительно зарекомендовали себя в экспериментах на животных в качестве методов, позволяющих замедлить прогрессирование ДН. Перспективной задачей является установление эффективности данных методов нефропротекции в клинике.

Выводы

1. Почечная экскреция ИФР-1 и ФРЭС у больных СД 1-го типа возрастает параллельно развитию нефропатии и достигает наибольшей выраженности у пациентов с протеинурией и почечной недостаточностью.
2. У больных с нормо- и микроальбуминурией экскреция ИФР-1 и ФРЭС отражает выраженность морфологических изменений в почках (утолщение базальных мембран, изменение малых отростков подоцитов и расширение мезангия клубочков), что позволяет рассматривать экскрецию данных факторов в качестве раннего маркера ДН.
3. Взаимосвязь изменений экскреции ИФР-1 и ФРЭС с качеством метаболического контроля СД подтверждает определяющую роль гипергликемии в развитии ДН.