Клинико-гормональная и молекулярногенетическая диагностика неклассической формы недостаточности 21-гидроксилазы у женщин репродуктивного возраста

Прогрессирующее в последние годы снижение рождаемости наряду с ухудшением показателей здоровья населения представляет собой одну из наиболее актуальных медико-социальных проблем современного общества. Многообразие репродуктивных нарушений, приводящих к бесплодию и невынашиванию желанной беременности, определяет заинтересованность врачей различных специальностей в решении проблемы сохранения здоровья женщины и рождения здорового потомства. Эндокринопатии вносят весомый вклад в формирование репродуктивной патологии [5]. Одной из наиболее частых причин нарушения репродуктивной системы вследствие гиперандрогенного воздействия на женский организм является неклассическая форма дефицита фермента 21-гидроксилазы, распространенность которой достигает 4% в популяции [2]. Диагностика неклассической формы 21-гидроксилазной недостаточности представляет определенные трудности ввиду отсутствия специфических клинических проявлений заболевания, неоднозначного подхода к интерпретации уровней биохимического маркера заболевания - 17-гидроксипрогестерона (17-ОНР) и ограниченной возможности применения молекулярно-генетического анализа. Клиническая картина заболевания дебютирует в период значительного функционального напряжения всех регуляторных механизмов женского организма. Зачастую таким провоцирующим фактором, впервые выявляющим скрытую дисфункцию стероидного синтеза, является беременность, наступающая спонтанно у половины пациенток с неклассической формой дефицита 21-гидроксилазы [6]. В то же время известно, что гиперандрогения любого генеза, в том числе адреналового, существенно повышает риск невынашивания беременности в ранние сроки гестации вследствие неблагоприятного воздействия на хорион [3, 4]. Верификация диагноза в I триместре беременности определяет выбор терапии с целью предотвращения репродуктивных потерь. Лабораторная диагностика неклассической формы дефицита 21-гидроксилазы основана на определении высокой концентрации патогенетического маркера врожденной ферментопатии - 17- ОНР. Согласно европейским критериям диагностики базальный уровень 17-ОНР выше 6 нмоль/л рассматривается как пограничный для диагностики недостаточности 21-гидроксилазы, а уровень выше 15 нмоль/л - как диагностический. При сомнительной оценке исходной концентрации 17- ОНР применяют стимуляционную пробу с синтетическим аналогом АКТГ короткого действия с определением содержания метаболита на пике стимуляции через 1 ч. Концентрация 17-ОНР до 30 нмоль/л исключает ферментативный дефект, значения в диапазоне 30-50 нмоль/л указывают на гетерозиготное носительство мутантного гена дефицита 21-гидроксилазы (CYP21), стимулированный уровень выше 50 нмоль/л рассматривается как диагностический [1, 9]. На отечественном фармацевтическом рынке отсутствуют синтетические аналоги АКТГ короткого действия, а используемая модификация пробы с аналогом АКТГ пролонгированного действия (синактен-депо) не имеет четких критериев оценки. У пациентов с дефицитом фермента 21-гидроксилазы определяется также повышение уровня сульфата дегидроэпиандростерона (ДГЭА-С) - основного андрогена надпочечникового происхождения [1, 4]. В период гестации оценка уровней ДГЭА-С и 17-ОНР затруднена ввиду особенностей гормональной секреции плаценты и высокой активности стероидогенеза матери и плода [7, 8], а проведение пробы с аналогом АКТГ у беременных не представляется возможным. Следствием ошибки на постаналитическом этапе является гипердиагностика врожденной ферментопатии и необоснованное назначение супрессивной глюкокортикостероидной терапии беременным. Внедрение в клиническую практику методов молекулярной диагностики позволяет с высокой точностью определить наличие наследственного заболевания при сомнительных результатах гормонального теста. Поиск новых специфических мутаций в гене CYP21 расширяет возможности диагностики неклассической формы дефицита 21-гидроксилазы. Цель - определить диагностическую ценность методов, применяемых для верификации неклассической формы недостаточности 21-гидроксилазы у женщин репродуктивного возраста. Материалы и методы По рекомендации кафедры акушерства и гинекологии Тюменской государственной медицинской академии (ТюмГМА) при поддержке Управления здравоохранения Тюмени беременные с угрозой прерывания настоящей беременности обследуются на сывороточные маркеры гиперандроге- нии. За период с 2002 по 2004 г. уровень ДГЭА-С как маркера функциональной надпочечниковой гиперандрогении определен у 3869 женщин, уровень 17-ОНР - у 424 из 11 260 беременных. Женщины, имеющие высокие концентрации метаболитов, определяемых в рамках селективного скрининга на гиперандрогению, рассматривались в качестве группы риска по наличию неклассической формы недостаточности 21-гидроксилазы. Исследования проводили методом конкурентного твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) с использованием тест-систем Activ DHEA-S DSL- 103500 и 17-ОН Progesteron ELISA, каталожный номер EIA-1292 (DRG Diagnostics), референтный интервал ДГЭА-С для беременных 0,2-1,2 мкг/мл, референтный интервал 17-ОНР для III триместра 2,0-12,0 нг/мл. вание пациенток осуществляли при наличии информированного Г~ L_^ ной клиники Ti )МГМ'А.! (ГЛ8ВНЫЙ проф. Л. А. Суплотова) По завершении гестации 134 женщины, отобранные методом случайной выборки из 2792 беременных с высокими показателями 17ОНР и ДГЭА-С, обследованы повторно с оценкой репродуктивного анамнеза, особенностей течения настоящей беременности, клинико-биохимических показателей гиперандрогении. Средний возраст обследованных составил 29,0 ± 4,7 года, женщины русские. 52 пациенткам выполнена стимуляционная проба с синтетическим аналогом АКТГ пролонгированного действия (синактен-депо, "Novartis") с оценкой базального и стимулированного уровня 17-ОНР. Препарат вводили внутримышечно в дозе 1000 мг, забор крови осуществляли до введения и через 9 ч после (на пике действия). Уровень 17-ОНР определяли методом твердофазного конкурентного ИФА с применением набора "DRG 17-а-ОН Progesteron Е 1F-1292" (США). Обследо- согласий на базе многоп эофиль- Таблица 1 Диагностически значимые уровни 17-ОНР у женщин группы риска по врожденной ферментопатии № пациентки Базальный уровень Стимулированный уровень кортизол, нмоль/л 17-ОНР, нмоль/л кортизол, нмоль/л 17-ОНР, нмоль/л 5 760 8,05 2000 54,5 18 530 13,3 1380 58,2 27 560 6,36 1500 60,6 58 720 7,3 2000 60,0 73 400 18,2 800 60,0 22 455 4,2 1330 38,5 97 740 15,7 2500 34,8 132 604 4,2 1453 35,4 Молекулярно-генетическое исследование выполнено 44 женщинам в генетической лаборатории Эндокринологического научного центра (ЭНЦ) РАМН (зав. лабораторией С. А. Прокофьев) методом аллельспецифической ПЦР с использованием специфических праймеров для истинного гена [10]. Определяли мутации гена CYP21, приводящие к аминокислотным заменам, характерным как для неклассического варианта (V281L, P30L, P453S), так и для классических форм (E3del, 30kb del, 12spl, R356W, Q318X, L306insT, V237E, G291S, int7, I172N) в случае гетерозиготного носительства мутаций неклассической формы дефицита 21-гидроксилазы. Режимы амплификации отрабатывали отдельно для каждой мутации. Для амплификации использовали амплификатор Терцик МС-2 (НПФ "ДНК-Технология", Россия). Детекцию результатов осуществляли путем электрофореза в 1-3% агарозном геле с добавлением этидиума бромида. Статистический анализ проводили на ПК с помощью программы Statistica 6,0 (StatSoft, Inc., 2001 г.). Значимость различий определяли с помощью критериев Манна-Уитни, Краскела-Уоллиса. Корреляционный анализ проводили с использованием критерия Спирмена. Применен расчет точности диагностического метода: Se = а/(а + с) • 100%, Sp = d/{d + b) • 100%, ТА = а + d/(a + с + b + d)- 100%, +PV = а/(а+ b) • 100%, -РИ= d/(d + с) • 100%. Различия между показателями считали достоверными при р < 0,05. Результаты и их обсуждение Анализ результатов селективного скрининга беременных на неклассическую форму дефицита 21- гидроксилазы показал превышение нормативных значений ДГЭА-С у 72% обследованных и превышение нормативных значений для III триместра у 10,5% женщин. Таким образом, диагноз врожденной ферментопатии поставлен 16% женщин от общей популяции беременных - все они получили рекомендации по применению супрессивной глюкокортикоидной терапии. В то же время оставалось неизвестным, является ли повышение концентрации метаболитов стероидного синтеза относительно лабораторной нормы отражением нарушенного стероидогенеза у беременных? Ассоциированы ли высокие концентрации аналитов в I триместре с формированием осложнений беременности, требующих назначения супрессивной глюкокортикоидной терапии? Ретроспективная оценка течения беременности у женщин с доказанной ферменто- патией позволит, на наш взгляд, определить диагностическую ценность повышения метаболитов стероидного синтеза в период гестации. Клинический осмотр 134 женщин с высокими показателями сывороточных маркеров гиперандрогении в I триместре беременности показал отсутствие специфических маркеров заболевания: все пациентки имели женский фенотип без признаков маскулинизации, гирсутное число - в пределах пограничных значений (индекс Ферримана-Голлвея от 7 до 12 баллов). У женщин группы риска по наличию врожденной ферментопатии частота репродуктивных нарушений в анамнезе (таких, как раннее адренархе, нарушения менструальной функции, бесплодие, невынашивание предыдущих беременностей) превышала частоту патологии в популяции, однако не имела достоверного уровня значимости (р > 0,05). Базальный уровень 17-ОНР, определяемый как патогенетический маркер 21-гидроксилазной недостаточности, у 34,3% женщин превышал предложенный референтный норматив (6,0 нмоль/л), но лишь у 5% женщин соответствовал диагностическому уровню неклассической формы недостаточности 21-гидроксилазы (> 15 нмоль/л). Таким образом, анализ клинико-анамнестических данных и определение базального уровня 17-ОНР не являются достаточными критериями для диагностики дефицита 21-гидроксилазы. Вторым этапом диагностики явилось проведение стимуляционной пробы с пролонгированным аналогом АКТГ, по результатам которой диагностический уровень 17-ОНР выше 50 нмоль/л определен у 9,6% женщин (табл. 1). Для диагностики неклассической формы недостаточности 21-гидроксилазы использовали молекулярно-генетический анализ, позволяющий исключить ложноположительные результаты гормонального теста. Наиболее распространенным дефектом гена CYP21 в популяции женщин Тюмени явились мутации, приводящие к аминокислотным заменам V281L, P453S при сочетанном нахождении химерного гена (30kb del). По нашему мнению, доказательством существования неклассической формы дефицита 21-гидроксилазы является сочетание высокого стимулированного уровня 17-ОНР (> 50 нмоль/л) и детектированной мутации в гене CYP21 (табл. 2). У 13,6% пациенток, имеющих высокие базальные и/или стимулированные уровни 17-ОНР, рас- Таблица 2 Показатели 17-ОНР у пациенток с неклассической формой недостаточности 21 -гидроксилазы № пациентки Мутация Базальный уровень 17-ОНР, нмоль/л Стимулированный уровень 17-ОНР, нмоль/л 27 V281L/V237E 6,36 60,6 58 30kb del/V281L 7,3 60,0 73 ЗОкЬ del/P453S 18,2 60,0 18 ЗОкЬ deI/V281L 13,3 58,2 # ЮО-i > i 40 ■ *''' | 20‘ - ° °0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Чувствительность, % Se-77,8%, Sp-58,1% Рис. 1. Точность метода определения базального уровня 17-ОНР для диагностики неклассической формы недостаточности 21-гидроксилазы. сматриваемые в качестве биохимических критериев диагностики ферментативной недостаточности, мутаций в кодирующей части гена CYP21 не обнаружено. Возможно, причиной дефекта стероидного биосинтеза в данном случае являются более редкие мутации, которые невозможно определить методом, использованным в нашем исследовании. У 32% женщин в отсутствие клинических признаков гиперандрогении (уровень базального и стимулированного 17-ОНР < 15 и < 30 нмоль/л соответственно) выявлены мутации в гене CYP21, наиболее частой из которых является P105L. Либо эти женщины могут быть гетерозиготными носительницами мутантного гена, и заболевание у них не разовьется, либо наличие P105L является проявлением нормального полиморфизма гена. Несмотря на то что все пациентки с доказанным дефектом стероидного синтеза в исследовании имели базальный уровень 17-ОНР > 6 нмоль/л, диагностика неклассической формы дефицита 21- гидроксилазы по изолированному его определению не представляется возможной: прогностическая ценность отрицательного результата (-PV) составляет 92,6% (рис. 1). Уровень 17-ОНР на пике стимуляции в диапазоне от 30 до 50 нмоль/л также не является достаточным критерием диагностики врожденной ферментопатии: прогностическая ценность положительного результата (+PV) составляет только 50%. Стимулированный уровень 17-ОНР > 50 нмоль/л в 80% случаев подтверждает наличие дефекта в гене CYP21 и может рассматриваться в качестве значимого критерия диагностики недостаточности 21-гидроксилазы. Общая точность сочетанного определения уровня базального и стимулированного 17-ОНР выше 6 нмоль/л и выше 50 нмоль/л соответственно составляет 70,4%, однако прогностическая ценность положительного результата (+PV) составляет также 80%, не увеличивая таким образом прогностическую ценность положительного результата при изолированном определении стимулированного уровня аналита > 50 нмоль/л. На основании полученных данных о наличии неклассической формы дефицита 21-гидроксилазы у женщин вне гестации нами проведена оценка диагностической значимости определения 17-ОНР и ДГЭА-С в I триместре беременности. Специфичность определения 17-ОНР в этот период для диагностики заболевания составляет только 25%, прогностическая ценность отрицательного результaта - 50%, что с равной вероятностью указывает на наличие ферментативного дефекта как в группе женщин с повышенным уровнем метаболита, так и в группе с нормальной концентрацией 17-ОНР. Специфичность определения ДГЭА-С в I триместре как маркера адреналовой гиперандрогении составляет только 15% при относительно высокой диагностической чувствительности метода 80%, прогностическая ценность отрицательного результата - 85,7% (рис. 2). Проведена ретроспективная оценка течения беременности в группе женщин с доказанным ферментативным дефектом по сравнению с женщинами - гетерозиготными носительницами мутантного гена CYP21 и здоровой популяцией. Не выявлено достоверных различий между группами по частоте определения высоких значений 17-ОНР и ДГЭА-С в I триместре и по частоте формирования андрогензависимых осложнений гестации (р > 0,05). Таким образом, повышение уровня 17-ОНР и ДГЭА-С во время гестации свидетельствует не о заболевании, а об изменении стероидогенеза в этот период, а наличие неклассической формы недостаточности 21-гидроксилазы не ухудшает течения спонтанно наступившей беременности. Выводы 1. Определение повышенных уровней 17-ОНР и ДГЭА-С в период гестации является низкоспецифичным методом диагностики недостаточности 21-гидроксилазы у беременных (специфичность 25 и 15% соответственно). Методом выбора в данном случае следует считать молекулярно-генетическую диагностику врожденной ферментопатии. Наиболее объективной представляется диагностика неклассической формы недостаточности 21-гидроксилазы у женщин на этапе планирования беременности. 2. В исследовании не выявлены достоверно значимые клинические маркеры неклассической формы врожденной дисфункции коры надпочечников у женщин вне гестации. Изолированное определение базального уровня основного патогенетического маркера недостаточности 21-гидроксилазы - 17-ОНР не позволяет диагностировать неклассическую форму заболевания в 92,6% случаев. 3. Наиболее эффективным методом диагностики неклассической формы недостаточности 21-гидроксилазы следует считать проведение стимуляционной пробы с синтетическим аналогом АКТГ продленного действия. Вероятность наличия заболевания при стимулированном аналогом АКТГ уровне 17-ОНР выше 50 нмоль/л составляет 80%. 4. Причиной нарушения активности фермента 21-гидроксилазы в исследовании явилось наличие сочетанных мутаций в гене CYP21 (30kd del/V281L, 30kd del/P453S, 30kd del/P105L, V281L/V237E). 5. Генотипически наиболее специфичными для неклассической формы недостаточности 21-гидроксилазы явились гомозиготные или сочетанные гетерозиготные мутации, приводящие к аминокислотным заменам в позициях V281L, Р453.