Preview

Влияние генетических факторов на результат терапии диффузного эутиреоидного зоба

https://doi.org/10.14341/probl200955114-18

Полный текст:

Аннотация

Целью настоящего исследования явилось изучение зависимости между распределением генотипов полиморфных маркеров генов TSHR (rs3783949, замена — А/С), NIS (rs 7250346, замена — C/G), DUOXI (rs2467825 замена — A/G), DUOX2 (rs7171366, замена G/Т), ТРО (rs 17091737, замена — G/Т) и результатом лечения диффузного эутиреоидного зоба (ДЭЗ) с использованием двух режимов: монотерапии препаратами йода и комбинированной терапии препаратами йода и левотироксина.


Для выявления более эффективного и безопасного метода лечения ДЭЗ сравнивались между собой объем щитовидной железы (ЩЖ), уровни тиреотропного гормона гипофиза и антител к тиреопероксидазе в двух группах: ''Монотерапия'' (п = 40) — KI(200мкг/сут) и "комбинированная терапия"(п = 41) — К1 (100мкг) +Ь-Т4(1 мкг/кг/сут). Каждая группа в зависимости от результата лечения была разделена на 2 подгруппы: "удовлетворительный результат" и "неудовлетворительный результат" (объем ЩЖне достигал пределов нормы или продолжал увеличиваться). Для оценки зависимости между полиморфизмом изучаемых генов и результатом терапии ДЭЗ был проведен корреляционный анализ.


Имелась достоверная корреляция (г = -0,39; р = 0,03) между распределением генотипов полиморфного маркера гена TSHR и результатом лечения ДЭЗ в группе "Монотерапия": при удовлетворительном результате преобладали генотипы АА + АС, а при неудовлетворительном — генотип СС. Достоверной корреляции между распределением генотипов изучаемых полиморфных маркеров и результатом лечения при помощи комбинированной терапии выявлено не было. Таким образом, результат лечения ДЭЗ с использованием монотерапии препаратами йода может зависеть от генетических факторов.

Для цитирования:


Галкина Н.В., Трошина Е.А., Мазурина Н.В. Влияние генетических факторов на результат терапии диффузного эутиреоидного зоба. Проблемы Эндокринологии. 2009;55(1):14-18. https://doi.org/10.14341/probl200955114-18

For citation:


Galkina N.V., Troshina E.A., Mazurina N.V. Influence of genetic factors on the result of therapy for diffuse euthyroid goiter. Problems of Endocrinology. 2009;55(1):14-18. (In Russ.) https://doi.org/10.14341/probl200955114-18

Диффузный эутиреоидный зоб (ДЭЗ) — общее диффузное увеличение щитовидной железы (ЩЖ) без нарушения ее функции. В подавляющем большинстве случаев причиной ДЭЗ является недостаточное поступление в организм человека йода. В настоящее время основными патогенетически оправданными методами лечения ДЭЗ являются монотерапия препаратами йода и комбинированная терапия препаратами йода и тироксина [1, 3]. В литературе существует много работ по сравнению эффективности этих двух режимов терапии [6, 8, 10, 11]. Данные различных исследователей по преимуществу одного метода лечения над другим противоречивы. Вероятно, это обусловлено межпопуляционными различиями того или иного региона и используемыми дозировками препаратов. Однако при детальном анализе большинства подобных исследований нельзя не заметить и нечто общее, а именно — наличие некоторого числа пациентов, которые "не отвечают" на проводимую терапию (non-responders). Например, G. Hintze и D. Emrich [6, 7] относят к ним тех больных, у которых, несмотря на курс 8-месячного лечения, объем ЩЖ уменьшился не более чем на 5% от исходного. Режим терапии, как правило, не оказывал влияния на ее результат. Резистентные пациенты имелись во всех трех сравниваемых группах: в группе, принимавших левотироксин, их доля составила 16,4%, в

Исходная характеристика изучаемых показателей в группах "монотерапия" и "комбинированна)

терапия”

Таблица 1

Группа

Пол

Средний возраст, годы

Ущж, мл

ТТГ, мЕд/л

АТ к ТПО, ME

Курение

Ж

м

Ме[Х 1/

4, X 3/4)

абс.

%

абс.

%

абс.

%

Монотерапия (л = 31)

29

94

2

6

28,0 ± 8,1

20,5[19,3; 23,5]

1[0,9-1,48]

0

17

59

Комбинированная терапия (л = 31)

29

94

2

6

28,4 ± 8,6

20,4[19,7; 21,3]

1,1(0,97-1,27]

0

15

45

Р

1

0,8

0,8

0,23

1

0,43

группе йодида калия (KI) — 12%, в группе комбинированной терапии (KI + L — Т4) — 14,6% [6]. Для проверки предположения, что устойчивость к терапии йододефицитного зоба имеет генетическую природу, нами было проведено настоящее исследование. В качестве генетических маркеров резистентности были использованы полиморфные сайты генов-кандидатов TSHR, NIS, DUOXI, DUOX2, ТРО.

Цель исследования — изучение зависимости между распределением генотипов полиморфных маркеров генов TSHR (rs 3783949, замена — А/С), NIS (rs 7250346, замена - C/G), DUOXI (rs2467825, замена — A/G), DUOX2 (rs7171366, замена — G/T), ТРО (rs 17091737, замена — G/Т) и результатом лечения ДЭЗ с использованием двух режимов терапии.

Материалы и методы

В исследование был включен 81 пациент с ДЭЗ — мужчины и женщины, отобранные в результате первоначального скринингового УЗИ ЩЖ 1520 жителей Москвы и дальнейшего клинического обследования согласно следующим критериям:

  1. Возраст не более 43 лет.
  2. Увеличение объема ЩЖ по данным пальпации (критерии ВОЗ, 2001 г.) и УЗИ (более 18 мл у женщин и более 25 мл у мужчин).
  3. Отсутствие узловых образований и гипоэхогенности структуры ЩЖ по данным УЗИ.
  4. Антитела (АТ) к тиреопероксидазе (ТПО) не определяются.
  5. Уровень тиреотропного гормона (ТТГ) в пределах нормальных значений.
  6. Отсутствие беременности.
  7. Отсутствие в анамнезе данных о патологии ЩЖ и/или получении препаратов йода, лития, а также тиреоидных гормонов, оральных контрацептивов в течение последних 6 мес. Пациенты, вошедшие в исследование, были рандомизированы с применением открытой таблицы случайных чисел на 2 группы: 1-я группа — "монотерапия" (л = 40) получала йодид калия в дозе 200 мкг в сутки (физиологическая суточная доза йода), 2-я группа — "комбинированная терапия" (л = 41) принимала левотироксин в дозе 1 мкг на 1 кг массы тела в сутки (доказанная минимально эффективная и безопасная доза для лечения ДЭЗ) совместно с йодидом калия в дозе 100 мкг в сутки (половинная доза относительно таковой в группе "монотерапия").

Лечение проводили 8 мес, а срок наблюдения за каждым пациентом составил 12 мес.

На момент завершения исследования число больных сократилось за счет некомплаенстных пациентов и составило 62 человека.

Каждая группа в зависимости от результата лечения была разделена на 2 подгруппы: 1-я подгруппа "удовлетворительный результат" — лица, у которых на фоне лечения объем ЩЖ достиг нормальных значений и оставался на том же уровне спустя 4 мес после отмены лечения; 2-я подгруппа "неудовлетворительный результат" — пациенты, у которых, несмотря на проводимую терапию, объем ЩЖ не достигал нормальных значений или имел тенденцию к дальнейшему увеличению на протяжении всего периода наблюдения.

Клиническое обследование включало в себя сбор анамнеза, пальпацию ЩЖ, определение ее объема и структуры по данным УЗИ, определение уровня ТТГ, АТ к ТПО, исследование распределения полиморфных маркеров генов TSHR, NIS, DUOXI, DUOX2, ТРО.

Исследование проводили в несколько этапов:

Скрининговое ультразвуковое исследование (УЗИ) ЩЖ с целью активного выявления ДЭЗ среди взрослых лиц, жителей Москвы.

Таблица 2. Сравнение основных показателей групп "монотерапия" и "комбинированная терапия" через 8 мес от начала лечения

Группа

^щж»

ТТГ, мЕд/л

Наличие АТ к ТПО

Ме[Х 1/4,

К 3/4]

количество больных, %

Монотерапия

16,4(13,0; 20,05]

0,9 [0,8; 1,1]

3

Комбинированная терапия

16,2 [15,0; 18,6]

1,2 [1; 48]

0

р

0,9

0,08

1

Таблица 3. Сравнение основных показателей пациентов групп "монотерапия" и "комбинированная терапия" через 12 мес от начала лечения

Группа

Ущж> мл

ТТГ, мЕд/л

Наличие АТ к ТПО

Ме[Х 1/4

X 3/4]

количество больных, %

Монотерапия

16,1 [13,1; 19,2]

0,9 [0,8; 1,1]

3

Комбинирован-

ная терапия

16,1 [13,1; 19,2]

1,2 [1; 1,48]

0

р

0,77

0,07

1

Рис. 1. Сравнение объема ЩЖ у пациентов групп "монотерапия" и "комбинированная терапия" через 8 мес от начала лечения.

  1. Генетическое одномоментное исследование распределения генотипов полиморфных маркеров генов TSHR (rs 3783949, замена — А/С), NIS (rs 7250346, замена - C/G), DUOXI (rs2467825, замена - A/G), DUOX2 (rs7171366, замена - G/T), ТРО (rsl7091737, замена - G/T).
  2. Проспективное открытое рандомизированное исследование по сравнению эффективности лечения ДЭЗ у взрослых: при помощи монотерапии препаратами йода и комбинированной терапии препаратами йода и тироксина.
  3. Оценка зависимости между полиморфизмом генов TSHR, NIS, DUOXI, DUOX2, ТРО и результатом терапии ДЭЗ.

УЗИ ЩЖ проводили в отделении функциональной диагностики эндокринологического научного центра (ЭНЦ) Росмедтехнологий с использованием ультразвукового сканера Hewlett Packard Image Point HX датчиком с переменной частотой 10 МГц, с полем зрения 3,5 см.

Определение уровня ТТГ в сыворотке проводили в лаборатории биохимии ЭНЦ (руководитель А. В. Ильин) методом усиленной хемолюминесценции с использованием автоматического анализатора "Architect" ("Abbott", США). Границы нормы для базального уровня ТТГ 0,25—3,5 мЕд/л.

Определение уровня АТ к ТПО в сыворотке также проводили в лаборатории биохимии ЭНЦ методом иммуноферментного анализа на диагностических наборах "Тироид ИФА-антитела ТПО" ("Ал- кор-Био", Россия). Границы нормы для базального уровня АТ к ТПО 0—40 Ед/л.

Генетические методы исследования rs3783949 (замена — А/С гена TSHR), rs7250346 (замена — C/G гена NIS), rs 2467825 (замена — A/G гена DUOXI), rs7171366 (замена — G/T гена DUOX2), rs 17091737, (замена — G/T гена ТРО) представляют собой нумерацию нуклеотидов согласно базе данных SNP (Database of Single Nucleotide Polymorphisms, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/), где содержится конкретная информация о каждом нуклеотиде. Анализ полиморфизма проводили методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) в лаборатории молекулярной генетики наследственных заболеваний Института молекулярной генетики РАН (дир. — проф. С. В. Костров).

Описание метода. Геномную ДНК выделяли методом фенолхлороформной экстракции после инкубации образцов протеинкиназой К в 0,1% растворе додецилсульфата натрия. ПЦР проводили на амплификаторе фирмы "ДНК-технология" (Россия) в пробирках "Eppendorf по 0,5 мл. Смесь для амплификации объемом 20 мкл содержала 2 мкл 10 • ПЦР-буфера (500 мМ трис-НС1, pH 8,8; 150 мМ (NH4)2SO4; 50 мМ MgCl2; 2 мг/мл BSA; 0,1% tween; 0,1% желатин); 1 мМ каждого dNTP, (dATP, dCTP, dGTP, dTTP); 5—10 пМ каждого праймера (количество их варьировало в зависимости от исследуемого локуса); 0,25 ед. термостабильной ДНК-полимеразы (Tag-полимераза, "Силекс", Москва); 0,1—0,2 мкг геномной ДНК и деионизированной воды до 20 мкл. Для анализа фрагментов ДНК, получаемых в ходе ПЦР, проводили вертикальный электрофорез в 6% ПААГ, 0,5 • ТВЕ. Для обнаружения наличия сайта рестрикции проводили рестрикционный анализ, включающий амплификацию исследуемого локуса, инкубацию реакционной смеси в течение ночи при соответствующей температуре и электрофорез. После окончания электрофореза гель выдерживали 5 мин в растворе бромистого этидия. Анализ геля проводили под ультрафиолетовым светом.

Статистический анализ данных провели с использованием пакета прикладных программ Statis- tica (StatSoft Inc. США, версия 6.0), MEDCALC, программного обеспечения MS Excel 2000 (Microsoft). Вид распределения оценивали с использованием теста Колмогорова—Смирнова. Количественные признаки, имеющие приближенно-нормальное распределение, описывали как М ± SD. Количественные признаки, не имеющие приближенно-нормального распределения, а также количественные признаки выборок малых объемов независимо от вида распределения описывали медианой и интерквартильным размахом — Me [X 1/4; X 3/4], качественные признаки описывали в виде процента и абсолютного значения. Так как большинство изучаемых показателей не имело приближенно-нормального распределения, для оценки достоверности их различий использовали непараметрический критерий Манна—Уитни. Анализ повторных изменений проводили при помощи непараметрического дисперсионного анализа методом Фридмана с дальнейшим последовательным сравнением групп по критерию Вилкоксона. Корреляционный анализ проводили с использованием непараметрического критерия Спирмена. Статистически значимыми считали различия при р < 0,05.

Рис. 2. Сравнение объема ЩЖ у пациентов групп "монотерапия" и "комбинированная терапия" через 12 мес (спустя 4 мес после прекращения лечения).

Таблица 4. Исходная характеристика показателей в подгруппах "удовлетворительный результат" и "неудовлетворительный результат" группы "ионотерапия"

Подгруппа

Пол

Ущж, МЛ

ТТГ, мЕд/л

м

Ж

Средний возраст, годы

Ме[Х 1/4; X 3/4]

абс.

%

абс.

%

             

Удовлетворительный результат (л = 25) Неудовлетворительный результат (л = 50)

4

24

96

27,3 ± 8,4

20,15 [19,2; 20,3)

1,0 [0,9, 1,4]

0

5

100

32,8 ± 6,01

21,0

[20, 5; 22, 25]

1,0 [0, 81: 1,55]

Результаты

На момент включения в исследование пациенты с ДЭЗ не отличались друг от друга по полу, возрасту и основным изучаемым показателям (табл. 1). Для оценки преимущества одного метода лечения над другим сравнивали основные параметры обеих групп. Данные представлены в табл. 2 и 3. Спустя 8 мес от начала приема препаратов медиана объема ЩЖ в группе "Монотерапия" составила 16,4 мл, в группе "комбинированная терапия" — 16,2 мл (рис. 1), а медианы уровней ТТГ — 1 и 0,8 мЕД/л соответственно. АТ к ТПО были выявлены у одной пациентки в группе "Монотерапия". Статистически значимых различий между уменьшением объема ЩЖ (р = 0,9), уровнем ТТГ (р = 0,08), АТ к ТПО (р = 1) при их сравнении в двух группах обнаружено не было. Через 12 мес наблюдения как в группе

Таблица 5. Анализ зависимости результата лечения ДЭЗ от генотипа в группе "монотерапия"

Ген

Результат лечения (удовлетворительный (л = 25)/неудовлетворительный (л = 5)

Г

Р

TSHR (АА + АС/СС)

-0,39

0,03

NIS (GG + CG/CC)

-0,15

0,43

DUOXI (AG + AA/GG)

0,0

1

DUOX2 (TT/TG + GG)

0,22

0,23

ТРО

0,18

0,33

"Монотерапия", так и в группе "Комбинированная терапия" медиана объема ЩЖ составила 16,1 мл (рис. 2), а уровней ТТГ — 0,9 и 1.2 мЕД/л соответственно. При сравнении показателей двух групп — уменьшения объема ЩЖ (р = 0,77), уровней ТТГ (р = 0,07) и АТ к ТПО (р = 1) достоверных различий между ними выявлено не было, т. е., спустя еще как минимум 4 мес после прекращения лечения, размеры ЩЖ оставались нормальными в обеих группах.

Таким образом, и монотерапия препаратами калий йодида, и комбинированная терапия препаратами калия йодида и левотироксина в равной степени эффективны и безопасны для лечения ДЭЗ у жителей Москвы.

Влияние генетических факторов на результат лечения ДЭЗ

В обеих сравниваемых группах были больные, которые оказались резистентными (устойчивыми) к проводимой терапии, т. е. имели неудовлетворительный результат (объем ЩЖ не достигал преде-

Рис. 3. Распределение генотипов полиморфного маркера rs 3783949, замена — А/С гена TSHR у пациентов с удовлетворительным и неудовлетворительным результатом лечения ДЭЗ в группе "монотерапия".

Таблица 6. Исходная характеристика показателей в подгруппах "удовлетворительный результат" и "неудовлетворительный результат" группы "комбинированная терапия"

Пол

Ущж, мл

ТТГ, мЕд/л

Подгруппа

абс.

%

абс.

к

%

Средний возраст, ГОДЫ

Ме[Х 1/4; ХЗ/4]

               

Удовлетворительный результат (п = 26)               2         8     24           92         27,7 ± 8,47               20,3 [19,7; 21,3]                1,05[0,9;1,3]

Неудовлетворительный результат (п = 4)             -          0       4          100        32,4 ± 10,36           20,95 [19,05; 22,5]             1,19 [1,09; 1,3]

Р                                                                     -                    0,09                           0,5                             0,98                               0,48

лов нормальных значений или имел тенденцию к дальнейшему увеличению).

Чтобы выяснить, имеется ли ассоциация между изучаемыми генотипами и результатом лечения ДЭЗ, был проведен корреляционный анализ.

Генотипы и результаты лечения в группе "монотерапия”

В генетическом исследовании участвовали 30 человек. Из них у 25 (83,4%) был отмечен, удовлетворительный результат, у 5 (16,6%) — неудовлетворительный. Лица обеих подгрупп изначально не отличались между собой по полу, возрасту, объему ЩЖ, уровню ТТГ (табл. 4). В табл. 5 представлены результаты корреляционного анализа. Как видно, имелась достоверная корреляция между распределением генотипов полиморфного маркера гена TSHR и результатом лечения ДЭЗ при помощи монотерапии препаратами калия йодида: в группе с удовлетворительным результатом преобладали геномы АА + АС, а в группе с неудовлетворительным результатом — генотип СС (рис. 3).

Генотипы и результаты лечения в группе "комбинированная терапия"

В генетическом исследовании участвовали 30 человек. У 26 (86,7%) из них отмечался удовлетворительный результат, у 4 (13,3%) — неудовлетворительный. Лица обеих групп изначально не различались между собой по полу, возрасту, объему ЩЖ, уровню ТТГ (табл. 6). Достоверной корреляции между распределением генотипов изучаемых полиморфных маркеров и результатом лечения ДЭЗ при помощи комбинированной терапии выявлено не было (табл. 7).

Обсуждение

На межиндивидуальные различия при назначении фармпрепаратов указывают авторы многих работ [2]. Фармакогенетические исследования показали, что данный факт может быть связан с наследственным полиморфизмом ферментов, участвующих в метаболизме лекарственных препаратов. Наиболее важную роль играет полиморфный ген CYP2D6, который катализирует гидроксилирование или деметилирование более 20% лекарственных веществ. Полиморфизм CYP2C9 также детерминирует индивидуальные и этнические различия фармакологического ответа. Этот фермент участвует в гидроксилировании примерно 16% лекарственных средств, а изменение его активности может препятствовать подбору оптимальных доз или приводить к возникновению токсических эффектов [9].

В нашем исследовании изучалась взаимосвязь между полиморфизмом генов-кандидатов тиреоидной патологии и резистентностью к основным методам терапии йододефицитного зоба. В группе "монотерапия" резистентных к терапии пациентов было 5 (16,6%), в группе "комбинированная терапия" — 4 (13,3%). Эти больные не отличались от остальных по полу, возрасту, степени увеличения ЩЖ и уровню ТТГ. Для выяснения возможного влияния генетических факторов на эффективность терапии ДЭЗ нами был проведен корреляционный анализ между распределением генотипов изучаемых полиморфных маркеров генов и результатом лечения пациентов обеих групп. Была выявлена достоверная корреляция между распределением генотипов полиморфного маркера гена TSHR и исходом лечения в группе "Монотерапия": у больных с удовлетворительным результатом преобладали генотипы АА + АС; напротив, носители СС генотипа чаще имели неудовлетворительный исход лечения. Среди пациентов, принимавших комбинированную терапию (K.I + L — Т4), никакой взаимосвязи между изучаемыми нами генотипами и результатом лечения выявлено не было. В настоящее время принято начинать лечение йододефицитного зоба с назначения препаратов йода. Это обусловлено этиотропным характером терапии, ее безопасностью, отсутствием необходимости в подборе дозы и в проведении частых гормональных исследований [4]. При отсутствии желаемого эффекта на первом этапе лечения генетическое обследование больного позволит определить возможную причину такой резистентности. При этом в качестве второго этапа целесообразен переход на комбинированную терапию препаратами йода и левотироксина.

Таблица 7. Анализ зависимости генотипа и результата лечения ДЭЗ в группе "комбинированная терапия"

Ген

Результат лечения (удовлетворительный (п = неудовлетворительный (л = 26)

Г

Р

TSHR (АА + АС/СС)

0,01

0,94

NIS (GG + CG/CC)

0,21

0,27

DUOXI (AG+ AA/GG)

0,11

0,57

DUOX2 (TT/TG + GG)

0,15

0,42

ТРО

0,5

0,78

Выводы

  1. Результат лечения ДЭЗ с использованием ионотерапии препаратами йода может зависеть от генетических факторов: носители генотипов АА и АС полиморфного маркера rs 3783949 гена TSHR чаще имеют удовлетворительный результат лечения, носители генотипа СС — неудовлетворительный результат.
  2. Результат лечения ДЭЗ при помощи комбинированной терапии не зависит от распределения полиморфных маркеров генов TSHR (rs3783949, замена — А/С), NIS (rs 7250346, замена — C/G), DUOXI (rs2467825, замена - A/G), DUOX2 (rs7171366, замена — G/Т), ТРО (rs 17091737, замена — G/Т) у взрослых лиц московской популяции.

Список литературы

1. Браверман Л. И. Болезни щитовидной железы. - М., 2000.

2. Вартанян Ф. Е. // Клин. фармакол. и тер. - 2006. - № 2. - С. 86-87.

3. Фадеев В. В. // Consilium medicum. - 2002. - Т. 4, № 10. - С. 516-520.

4. Фадеев В. В. Заболевания щитовидной железы в регионе легкого йодного дефицита: эпидемиология, диагностика, лечение. - М., 2005.

5. Edmonds C. // Clin. Endocrinol. - 1992. - Vol. 36, N 1. - P. 21-23.

6. Hintze G., Emrich D., Koebberling J. // Horm. Metab. Res. - 1983. - Vol. 17, N 7. - P. 362-365.

7. Hintze G., Emrich D., Koebbering J. // Eur. J. Clin. Invest. - 1989. - Vol. 19, N 6. - P. 527-534.

8. Horze A., Bockosch F., Briele B., Horst M. // Nuc Compact. - 1989. - Vol. 20. - P. 166-170.

9. Marez D., Legrand R. et al. // Pharmacogenetics. - 1997. - Vol. 7. - P. 193-202.

10. Nauman J., Glinoer D., Braverman L. E., Hostalek U. The Thyroid and Iodine. - New York, 1996.

11. Wilders-Truschnig M. M., Warnkross H., Leb G. // Clin. Endocrinol. (Oxford). - 1993. - Vol. 39, N 3. - P. 281-286.


Об авторах

Н В Галкина

Эндокринологический научный центр


Россия


Е А Трошина

Эндокоинологический научный центр


Россия


Н В Мазурина

Эндокринологический научный центр


Россия


Для цитирования:


Галкина Н.В., Трошина Е.А., Мазурина Н.В. Влияние генетических факторов на результат терапии диффузного эутиреоидного зоба. Проблемы Эндокринологии. 2009;55(1):14-18. https://doi.org/10.14341/probl200955114-18

For citation:


Galkina N.V., Troshina E.A., Mazurina N.V. Influence of genetic factors on the result of therapy for diffuse euthyroid goiter. Problems of Endocrinology. 2009;55(1):14-18. (In Russ.) https://doi.org/10.14341/probl200955114-18

Просмотров: 9


Creative Commons License
Контент доступен под лицензией Creative Commons Attribution 4.0 License.


ISSN 0375-9660 (Print)
ISSN 2308-1430 (Online)