Диагностические возможности определения биологически активного свободного тестостерона в крови с использованием современной технологии ультрафильтрации

В настоящее время трудности диагностики андрогенного дефицита связаны, в частности, с отсутствием адекватного маркера, а также чувствительного и специфичного метода его определения. В начале 2007 г. опубликовано официальное заявление Международной ассоциации эндокринологов о недопустимости использования прямых неэкстракционных методов определения общего тестостерона в диапазоне его низких концентраций (<11 нмоль/л), поскольку это ведет к ошибкам в диагностике с последующим назначением неправильного лечения [10].

Согласно современным представлениям о свободных формах циркулирующих в крови гормонов, уровень свободного тестостерона (св.Т) отражает андрогенный статус более адекватно, чем содержание в крови общего тестостерона (об.Т) [4]. Поэтому разработка надежных аналитических методов определения св.Т обеспечила бы наиболее надежную диагностику андрогенного статуса пациента.

Коммерческие диагностические наборы для прямого измерения свободных стероидов, в особенности тестостерона, в крови, пока не применимы для диагностического исследования и могут использоваться лишь в научных целях [3, 11]. Группой Vermeulen предложена формула для расчета концентрации св.Т на основе определения в крови об.Т и глобулина, связывающего половые гормоны (СССГ) [13], что требует четкого представления об истинных концентрациях об.Т и СССГ. Однако современные автоматизированные методы измерения об.Т дают неоднозначные результаты; нижний предел референсного интервала в различных лабораториях варьирует от 4,5 до 15,6 нмоль/л, т. е. разброс достигает 350% [2, 5, 9, 12]. Необходимость определения СССГ значительно удорожает стоимость такого подхода.

Традиционно отделение св.Т от тестостерона, связанного с белками сыворотки, проводится методом равновесного диализа, позднее появился метод ультрафильтрации (УФ). Технология УФ, предложенная рядом авторов, позволяет точно выделять свободные формы тестостерона и других стероидов [7, 8]. При этом необходим сверхчувствительный и высокоспецифичный метод определения низкой концентрации св.Т в фильтрате. Группа авторов, выполнив большое сравнительное исследование, рекомендовала использовать в качестве метода, разделяющего общий и свободный Т, технологию УФ вместо диализа с последующим количественным измерением концентрации св.Т методом масс-спектрометрии [14].

Поскольку точное определение уровня св.Т в крови сопряжено с технологическими трудностями, параллельно ведутся исследования по его определению в другой биологической жидкости — слюне, куда поступают только свободные формы стероидов, включая тестостерон (гормон, связанный с СССГ и альбумином, задерживается на мембране слюнных желез [15]).

Метод определения тестостерона в слюне прост, неинвазивен и имеет большие преимущества перед традиционными методами определения концентрации стероидов в венозной крови, взятие проб которой требует квалифицированного персонала и само по себе является добавочным стрессорным фактором, способным искажать гормональные параметры.

В процессе развития методов гормонального анализа неоднократно предпринимались попытки использования слюны в качестве биологической среды для диагностики гормональных нарушений. Однако радиоиммунологический анализ, а в последующем и иммуноферментные методы, не обладали достаточной чувствительностью, необходимой для определения низких концентраций свободных стероидов в слюне. Поэтому для анализа были необходимы большие объемы слюны (до 3 мл) и последующая экстракция огнеопасным и взрывоопасным диэтиловым эфиром. Такую технологию невозможно адаптировать для рутинного использования в клинических гормональных лабораториях.

Появление современной технологии иммуноанализа, основанной на усиленной хемилюминесценции (LIA), сочетающей ультрачувствительность и высокую специфичность, сделало возможным определение низких концентраций в малых объемах [1].

Целью настоящей работы являлось изучение возможности LIA в оценке андрогенного статуса по содержанию св.Т в слюне и в сыворотке при использовании в качестве разделяющего метода технологии УФ.

Материалы и методы

Пробы крови и слюны были собраны от 189 мужчин, обратившихся в клинику Эндокринологического научного центра для подтверждения или исключения диагноза различных форм гипогонадизма, возрастного андрогенного дефицита, сексуальной дисфункции и других нарушений гормональной функции яичек. Возраст пациентов колебался от 19 до 83 лет.

Кровь брали из локтевой вены натощак в 9— 10 ч утра. После ее центрифугирования сыворотки ал и квотировал и по 0,5 мл в 3 пробирки и хранили до анализа при —20°С. Для определения концентрации св.Т в слюне три ее порции отбирали в течение 1 ч с интервалом в 20 мин; перед тестированием равные количества всех взятых проб слюны смешивали, усредняя концентрацию св.Т, реально отражающую уровень гормона. Пробы, контаминированные кровью (концентрация тестостерона в которой в 10—15 раз выше, чем в слюне), исключали из анализа. Слюну хранили при —20°С. Перед тестированием пробы размораживали и центрифугировали. Св. Т измеряли в 50 мкл слюны в дубликатах.

Уровень об.Т и СССГ в пробах крови определяли методом усиленной хемилюминесценции с помощью автоматических анализаторов Vitros ECi (Ortho-Clinical Diagnostics, J&J, Великобритания) и Elecsys 2010 (Hoffmann—La Roche) соответственно. Концентрацию св.Т в сыворотке определяли после отделения св.Т методом УФ. Пробы сыворотки (0,5 мл) помещали в вертикальный центрифужный фильтр Amicon® Ultra-4 (MILLIPORE) с мембраной 30К — 30,000 NMWL. Затем добавляли 0,7 мл буфера (pH 7,4) следующего состава (в граммах на 1 л бидистиллированной воды): HEPES — 12,57; NaCl - 5,265; КН₂РО₄ - 0,224; MgSO₄ • 7Н₂О - 0,275; мочевина — 0,3; СаС1₂ • 2Н₂О — 0,275; NaOH -0,9.

Смесь сыворотки с буфером инкубировали 30 мин на водяной бане при 37°С, затем центрифугировали 15 мин при 37°С и 5250 g; центрифугу предварительно прогревали в течение 30 мин при 37°С в работающем режиме (5250 g). Уровень св.Т в ультрафильтрате определяли методом усиленной люминесценции LIA (IBL-Гамбург, Германия), основанном на принципе конкурентного связывания. Люминесцентный сигнал регистрировали на мультианализаторе Victor ("Wallac", Финляндия).

Концентрацию св.Т в слюне определяли также LIA-методом для сравнения ее с аналогичным показателем в ультрафильтрате сыворотки. Метод адаптирован нами для прицельной диагностики андрогенного дефицита у мужчин и женщин. Подробная процедура анализа описана ранее [6].

Концентрацию св.Т в крови вычисляли по формуле с учетом содержания в крови об.Т и СССГ [13] (сайт в Интернете http://www.issam.ch/freetes- to.htm).

Полученные данные обрабатывали с помощью программы Statistica for Windows, StatSoft, Inc. (1999). Результаты представлены в виде медианы и 2,5/97,5-процентилей. Соответствие распределения показателей нормальному оценивали по критерию Колмогорова—Смирнова. При р < 0,05 распределение признака считалось отличающимся от нормального. Для оценки связи между различными показателями был использован ранговый тест Спирмена. Различия при р < 0,05 считали статистически значимыми.

Результаты и их обсуждение

Суммарные показатели у обследованных мужчин представлены в табл. 1.

Наблюдаются значительные различия средних значений показателей, определенных различными методами. По нашим данным, уровень св.Т (в % от общего) составил (медиана и 2,5/97,5-процентили) 2,6% (1,0—8,1%) при определении в слюне, 1,9% (1,1—2,7%) — при расчетном способе и 0,9% (0,21—2,1%) — при определении в сыворотке с предварительной УФ.

Таблица 1. Гормональная характеристика пациентов (л = 189), включенных в исследование

С помощью УФ и последующего количественного измерения концентрации св.Т референсным методом масс-спектрометрии его содержание в сыворотке мужчин другие авторы находили равным 1,8% от об.Т, а при использовании диализа — 2,2% [7].

Связь между анализируемыми параметрами оценивали по ранговому тесту Спирмена (табл. 2).

Статистически значимая корреляция регистрировалась между всеми определяемыми маркерами андрогенного гомеостаза: об.Т, св.Т в крови (УФ), св.Т в крови (расчетный метод) и св.Т в слюне. Наиболее сильная связь наблюдалась между об.Т и расчетным св.Т. Наличие такой связи заключено в самом принципе расчетного метода, в котором концентрация об.Т (наряду с содержанием СССГ) является детерминантой св.Т. Показатели св.Т в крови после УФ сохраняли значимую положительную связь с показателями расчетного св.Т. Более слабая зависимость характерна для показателей св.Т в слюне.

Необходимо подчеркнуть, что коэффициент корреляции не отражает существования причинно- следственных связей. Для выявления андрогенного дефицита необходимо знать абсолютные концентрации тестостерона.

Для количественной оценки абсолютных показателей все пациенты были условно разделены на 2 группы, исходя из нижней границы интервала референсных значений об.Т в крови (> 11 и < 11 нмоль/л соответственно).

Можно видеть, что в зависимости от содержания об.Т в выделенных подгруппах статистически значимо снижаются все исследуемые показатели св.Т.

Таблица 2. Корреляция анализируемых показателей

Примечание, расч. — расчетный.

Таблица 3. Показатели св. Т у мужчин (медиана и 2,5/97,5 процентили)

Примечание, р < 0,001 между показателями у пациентов двух групп.

При расчете среднего показателя СССГ медиана для подгруппы с нормальным и высоким содержанием об.Т составила 38,7 нмоль/л, для подгруппы с низким содержанием об.Т —     28,2 нмоль/л

(р = 0,001). Однако корреляции между показателями св.Т и СССГ не наблюдалось ни в одном случае. Это связано со сложностью белковых взаимодействий гормонов и разнообразием факторов, модулирующих содержание СССГ в сыворотке.

В обеих группах сохранялась корреляция, характерная для всей группы в целом.

Интересно, что в подгруппе пациентов с нормальным содержанием об.Т регистрировалось значимое снижение показателя св.Т с возрастом пациентов (г = -0,22, р < 0,02), тогда как в отношении об.Т эта зависимость не прослеживалась. В подгруппе с содержанием об.Т менее 11 нмоль/л корреляция отсутствовала между всеми показателями.

При анализе процентного соотношения св.Т и об.Т в подгруппах (табл. 4) выявлено статистически значимое повышение св.Т в слюне и расчетного св.Т у пациентов с содержанием об.Т ниже референсного предела.

Относительно низкий процент св.Т в ультрафильтрате может быть связан с более точным выделением именно свободной фракции гормона, тогда как расчетные показатели в сыворотке и особенно в слюне могут включать некоторое количество св.Т из легко диссоциирующей его связи с альбумином.

Если при анализе результатов в качестве пограничного критерия норма/андрогенный дефицит использовать нижний предел референсных значений, то, по данным расчетного метода, сниженная концентрация св.Т определялась в 15% случаев (референсный интервал 225—545 пмоль/л); по результатам определения в слюне — в 18% случаев (референсный интервал 260—555 пмоль/л), при определении об.Т и св.Т в сыворотке с предварительной УФ — в 20 и 38% случаев (референсные интервалы 11—34 и 110—368 пмоль/л соответственно). Согласно этим данным, уровень св.Т в сыворотке, определяемый с предварительной УФ, является более чувствительным и точным маркером различных форм андрогенных нарушений у мужчин. Однако для подтверждения результатов всегда необходим учет клинических показателей.

Таблица 4. Процент св.Т от об.Т в группах (медиана и 2,5/97,5 процентили)

Технология УФ для разделения свободного и связанного с белком тестостерона была выбрана нами как наиболее быстрая, доступная и простая. При отработке методики мы придерживались опубликованных ранее рекомендаций по оптимальному проведению УФ. Группа авторов провела большое исследование по различным типам мембран, их адсорбционным свойствам, влиянию температуры, pH и разведения исходной сыворотки [14]. Относительно адсорбционных исследований лучшие результаты показали устройства, изготовленные из восстановленной целлюлозы с низко связывающей мембраной (адсорбция 2,0 ± 1,5%). Для поддержания термодинамического равновесия между свободной и связанной фракцией исследуемого гормона выбрана температура 37°С и физиологическое значение pH 7,4. Влияние на равновесие оказывает продолжительность проведения ультрафильтрации, которая в свою очередь зависит от исходного объема пробы и ее вязкости. Эксперименты с разведением показали в 4 раза большую адсорбцию гормона в нативной сыворотке по сравнению с разведенной, а также установили, что небольшие разведения (1:1,4) снижают концентрацию об.Т и оказывают лишь незначительный эффект на концентрацию св.Т (0,3 ± 1,6%). Разница становится значимой при разведении 1:10 (13,7 ± 4,1%). Подобные эффекты согласуются с законом действия масс. На основании детального анализа вышеизложенных данных, процесс УФ был проведен нами в оптимальных условиях (см. раздел Материалы и методы), что дает возможность говорить о надежности полученных результатов. Высокая аналитическая (6,2 пмоль/л) и функциональная (17,3 пмоль/л) чувствительность LIA-метода позволяет количественно определять очень низкие (2—3 пг в пробе) концентрации тестостерона в ультрафильтрате и в слюне, что особенно важно для диагностики андрогенного дефицита у мужчин, а также оценки андрогенного статуса у женщин и детей.

Вывод

Уровень св.Т, определяемый в слюне и в сыворотке с предварительной УФ и использованием ультрачувствительного метода усиленной люминесценции, может служить надежным маркером различных форм нарушений андрогенного статуса.