Изучение биологических свойств структурных аналогов половых стероидов с целью создания лекарственных препаратов

Излагаемые ниже материалы являются результатом многолетнего творческого сотрудничества коллективов лаборатории биологических исследований гормональных соединений и лаборатории химии стероидов и простагландинов (зав. — проф. К. К. Пивницкий) Института экспериментальной эндокринологии Эндокринологического научного центра РАМН.

Основными объектами изучения являлись структурные аналоги половых стероидных гормонов. Исследования преследовали 2 цели: теоретическую — изучение структурно-функциональных отношений в молекулах половых стероидов и практическую — изыскание потенциальных лекарственных средств на базе этих исследований.

Синтез стероидных соединений осуществляли сотрудники лаборатории химии стероидов и простагландинов В. М. Ржезников, Л. Е. Голубовская, О. Н. Минайлова и др. Исследование комплекса биологических свойств синтезированных аналогов проводили Т. И. Иваненко, Е. В. Покровская, Н. В. Олейник, И. Н. Баранова, В. В. Пучкова.

Изучение диссоциации биологических свойств при химической модификации тестостерона позволило в свое время обнаружить среди исследуемых соединений препарат с высокой анаболической активностью и подавленными половыми функциями. Результатом этих длительных исследований было создание препарата силаболина, который успешно прошел клинические испытания и был внедрен в медицинскую практику как высокоэффективный анаболик длительного действия.

В последние годы усилия сотрудников обеих лабораторий были сконцентрированы на изучении аналогов женских половых гормонов. Принцип исследований строился на одновременной оценке связывания стероидов с белками — рецепторами матки in vitro (методом конкурентного анализа) и in vivo (методом лигандного обмена)

о

R,=H'> сосну COCnHc R|-Hi сосну, сос_гн₅ н_г=н-, соси,

Контрацсптивная активность соединений I—VII по сравнению с этииилэстрадиолом (введение PER OS)

Рис. 1. Нитроксипроизводные эстрона и этинилэстрадиола.

при сопоставлении с действием препаратов на массу матки (утеротропный тест). Исследовали также антиэстротенные и антигонадотропные свойства аналогов с помощью соответствующих методов биотестирования. Сопоставление эффектов, полученных при парентеральном и оральном введении препаратов, дало возможность оценить их устойчивость к ферментативным влияниям и кислотно-щелочным контрастам пищеварительного тракта.

Проведенные исследования позволили объединить аналоги в 3 основные группы.

1. Соединения, имеющие примерно равную способность связываться с рецепторами in vitro и давать биологический эффект при введении в организм.
2. Соединения, конкурентно неактивные in vitro, но оказывающие выраженное утеротропное (эстрогенное) действие. Эти соединения, по-видимому, метаболизируют в организме до более активных стероидов.
3. Некоторые структурные аналоги эстрогенов имеют выраженное сродство к рецепторам in vitro, но не дают эффекта в утеротропном тесте, т. е. не проявляют специфических гормональных свойств. Причиной такого феномена может быть их метаболизм до неактивных соединений или краткосрочность пребывания гормон-рецепторного комплекса в ядре клетки-мишени, что не позволяет индуцировать увеличение мышечной массы матки. В последнем случае обычно констатируют лишь ранние эстрогенные эффекты (накопление воды в матке).

Для дальнейших исследований представляли интерес первые 2 группы стероидов.

Скрининг аналогов эстрона, эстрадиола, эстриола на наличие эстрогенной, антигонадотроп- ной и контрацептивной активности позволил обнаружить широкий спектр диссоциации этих функций, присущих половым стероидам. С позиций поиска потенциальных лекарственных препаратов наибольший интерес представляли соединения с высокой эстрогенной или антиэстрогенной активностью, а также аналоги, обладающие выраженными контрацептивными свойствами. Одновременно осуществляли отбор соединений, активных при оральном введении. Охарактеризованные нами антиэстрогены были включены в программу совместных исследований с Онкологическим научным центром РАМН как гормоноцито-

Производные эстрона

Примечание. ИБ50 — доза, вызывавшая ингибицию беременности на 50%. И К — индекс контрацепции, равный отношению контрацептивной активности к утеротропной активности, статики и проявили себя эффективными противоопухолевыми соединениями. Несколько исследованных аналогов с гормональной активностью, превышающей активность природных эстрогенов, могут быть использованы в медицинской практике в заместительной терапии.

В отношении контрацептивных свойств наиболее интересной оказалась группа нитроксипроиз- водных эстрона и особенно этинилэстрадиола (рис. 1). Отличительной чертой соединений этой группы является то, что контрацептивный эффект у них проявляется при оральном введении. В табл. 1 представлен индекс контрацепции некоторых исследованных соединений. Среди нитрокси- производных этинилэстрадиола уникальным оказался 11-нитрат, 3,17р-диацетат-окси-9а, 11р-ди- окси-этинилэстрадиол (соединение I), названный нистранолом. Его эстрогенная активность в утеротропном тесте превышала таковую этинилэстрадиола в 4,7 раза, в то время как контрацептивная активность была выше в 21 раз. Индекс контрацепции был в 4,6 раза выше, чем у этинилэстрадиола.

При более глубоком изучении нистранола обнаружено, что это соединение не способно конкурировать с природными эстрогенами за связывание с их рецепторами in vitro (табл. 2), но обладает этой способностью при введении в организм (метод лигандного обмена). Через 24 ч после введения животным нистранола его связывание с рецепторами эстрадиола существенно превышало таковое этинилэстрадиола. Соответственно этому увеличение массы матки в этот срок было наи-

Таблица 2

Относительная конкурентная способность нистранола

Рис. 2. Влияние нистранола и этинилэстрадиола на связывание эстрадиола цитозольной фракцией матки ("метод обмена"; а) и массу матки (б) неполовозрелых крыс.

Влияние нистранола и этинилэстрадиола на биосинтез суммарных РНК в культивируемых гепатоцитах. Включение ³Н-уриди- на (в имп/мин на лунку)

Примечание. Здесь и в табл. 4 р — достоверность различий с контролем. В скобках — число наблюдений.

I — эстрадиол, 2 — этин ил эстрадиол, 3 — нистранол.

По осям ординат — связывание эстрадиола в цитозоле матки (в %); б — масса матки (в мг); по осям абсцисс — срок исследования (в ч).

большим по сравнению с таковым при введении эстрадиола и этинилэстрадиола (рис. 2). Отсутствие рецепции в опытах in vitro связано, видимо, с тем, что обе ответственные за связывание с рецепторами С3- и С|7-гидроксильные группы в ни- страноле защищены ацетоксильными заместителями. В организме же, вероятно, происходит гидролиз этих сложноэфирных группировок с образованием биологически активных метаболитов. Предполагается, что комплекс стероид—рецептор длительное время удерживается в клетке (ядре). Это подтверждается долгим периодом (более 24 ч) снижения концентрации цитозольных рецепторов эстрадиола в тканях матки крыс.

Справедливость такого предположения подтверждена наличием эффекта пролонгации биологического действия нистранола. Показано, что после однократного введения препарата per os прирост массы матки неполовозрелых крыс в последующие 7 дней непрерывно увеличивался по сравнению с контролем и в 2 раза превосходил таковой после введения аналогичной дозы этинилэстрадиола (рис. 3).

Возможность возникновения обменных и сосудистых нарушений при длительном применении двухкомпонентных оральных контрацептивов (ОК) связывают преимущественно с эстрогенной компонентой препаратов. В связи с этим были проведены исследования по сравнению влияния нистранола и этинилэстрадиола на состояние липидного и белкового обмена. Использование различных доз стероидов позволило установить, что лишь при превышении в 500 раз терапевтической дозы эстрогена, применяемого в ОК, нистранол вызывал снижение концентрации холестерина и триглицеридов в крови. Меньшие дозы препарата не влияли на эти показатели липидного обмена. Этинилэстрадиолу, напротив, было свойственно гипертриглицеридемическое действие при некоторых дозах.

В исследовании на культуре гепатоцитов получены эффекты нистранола, сравнимые с таковыми этинилэстрадиола, которые заключались в стимулирующем влиянии на биосинтез суммарных РНК (по включение ³Н-уридина; табл. 3) и биосинтез белка (по включению С^!4-лейцина; табл. 4). Последующее общетоксикологическое изучение нистранола также не выявило каких-либо нежелательных побочных эффектов.

Уникальные свойства нистранола (его высокая контрацептивная активность при оральном введении) сделали его предпочтительным (по сравнению с этинилэстрадиолом) компонентом в качестве эстрогенного фрагмента в двухкомпонентном контрацептивном препарате. Наличие синтезированного в Научно-исследовательском химико-фармацевтическом институте и утвержденного Минздравом Российской Федерации гестагена ацетомепрегенола дало возможность объединить

Рис. 3. Интенсивность и продолжительность действия нистранола и этинилэстрадиола при однократном введении неполовозрелым самкам крыс.

а — подкожное введение; б — оральное введение. / — нистранол; 2 — этинилэст- радиол. По осям ординат — прирост массы матки (в мг); по осям абсцисс — срок исследования (в днях).

Таблица 4

Влияние нистранола и этинилэстрадиола на биосинтез белка в культивируемых гепатоцитах. Включение С|₄-лснцина (в имп/мин на лунку)

 CH,

Рис. 4. Нитрогест.

оба соединения в едином препарате и попытаться создать современный ОК на базе отечественных компонентов. В дальнейшем препарат получил название "Нитрогест" (рис. 4).

Приступая к созданию и изучению этого нового двухкомпонентного контрацептивного препарата, мы исходили из того, что его будущее как лекарственного средства может состояться лишь при условии, что он не уступит современным ОК в активности, т. е. обеспечит надежную гарантию предотвращения беременности, а также безопасность применения. Результаты проведенных исследований нистранола давали нам надежду на создание высокоэффективного низкодозирован- ного препарата.

В большинстве современных двухкомпонентных ОК в качестве эстрогенного компонента используют этинилэстрадиол (табл. 5), причем доза его в таблетке составляет 30 мкг и выше, что при длительном использовании ОК может давать нежелательные побочные эффекты (нарушение липидного обмена, сосудистые изменения и др.). В связи с этим все наши дальнейшие исследования были ориентированы на изучение сочетаний нистранола и ацетомепрегенола, в которых доза эстрогена была заведомо ниже доз этинилэстрадиола, применяющихся в мировой практике создания двухкомпонентных ОК.

Сочетание нистранола с ацетомепрегенолом в различных количественных соотношениях показало в экспериментах на крысах 100% ингибицию беременности, в то время как компоненты трик- вилара, марвелона, ортоновума, эгестренола в

Рис. 5. Контрацептивный эффект нитрогеста по сравнению с официнальными ОК в монофазном варианте доз.

а — эстроген; о — гестаген. I — нитрогест; 2 — марвелон; 3 — триквилар; 4 — ор- тоновум; 5 — эгестренол. По оси ординат — ингибиция беременности (в %); по оси абсцисс — дозы (в мг/кг/день).

сравнимых дозах вызывали лишь частичный эффект (рис. 5). Более того, 100% эффект сохранялся и при дальнейшем снижении дозы нистранола при неизменном количестве ацетомепрегенола.

У нитрогеста обнаружен и посткоитальный контрацептивный эффект, когда препарат вводили крысам на 1—2-й день беременности. При этом действующие дозы препарата были на 2 порядка ниже, чем дозы известного гестагенного контрацептива RU-486, который применяют для прерывания беременности на ранних сроках или вызывания аборта на поздних сроках беременности (табл. 6).

Дальнейшими исследованиями показано, что нитрогест интенсивно влияет на уровень половых гормонов в крови. 30-дневное введение крысам комбинации нистранола с ацетомепрегенолом приводило к исчезновению стадии проэструса и эструса, уровень лютеинизирующего гормона (ЛГ) при этом был ниже чувствительности радиоимму- нологического метода определения содержания этого гормона (табл. 7). В то же время длитель- Таблица 5

Двухкомпонситныс ОК монофазного типа

Таблица 6

Контрацептивные эффекты нитрогеста и RU-486 при подкожном введении самкам крыс

Влияние комбинаций ацетомепрегенола с нистраиолом и этини- лэстрадиолом на уровень ЛГ в сыворотке крови самок крыс

Примечание. * — чувствительность метода в данных условиях опыта. Суммарные дозы за 30 дней введения: эстроген — 0,5 мг/кг, гестаген — 1,5 мг/кг.

ное введение нитрогеста в желудок не влияло на концентрацию пролактина в крови, равно как и введение аналогичных доз препарата сравнения — марвелона.

В Институте медицинской приматологии РАМН (дир. — акад. РАМН Б. А. Лапин) исследовали характер влияния нитрогеста на содержание в крови эстрадиола и прогестерона на самках павианов гамадрилов. 21-дневное оральное введение препарата и марвелона (препарат сравнения) в равной степени предотвращало пики повышения уровня половых гормонов в ходе астрального цикла (рис. 6). После прекращения эксперимента все обезьяны, получавшие нитрогест, перенесли беременность, закончившуюся рождением здоровых детенышей (данные Н. Д. Гончаровой).

В результате проведенных исследований составлена лекарственная форма нового низкодози- рованного двухкомпонентного ОК монофазного действия. При соотношении доз, принятом в большинстве аналогичных ОК — 1:5, количество нистранола и ацетомепрегенола, входящих в таблетку, было меньше, чем в применяющихся в настоящее время ОК. Если широко известный низ- кодозированный ОК монофазного действия марвелон содержит 30 мкг этинилэстрадиола и 150 мкг дезогестрела, то таблетка нитрогеста состоит из 25 мкг нистранола и 125 мкг ацетомепрегенола.

6

Рис. 6. Динамика уровня эстрадиола (/) и прогестерона (2) в плазме периферической крови у обезьяны № 1639 на протяжении менструального цикла в контрольный период (о), на фоне введения нитрогеста (б) и восстановительный период (в).

По осям ординат: слева — концентрация эстрадиола (в нг/мл), справа — концентрация прогестерона (в нг/мл); по осям абсцисс — дни цикла.

Токсикологические исследования нитрогеста и его эстрогенного компонента нистранола, проведенные в отделе токсикологии Кардиологического научного центра РАМН, показали их низкую токсичность при однократном введении и хорошую переносимость при назначении в условиях длительных хронических экспериментов на крысах и собаках.

По завершении биологических исследований научно-техническая документация по препарату "Нитрогест" передана в Фармакологический комитет Минздрава Российской Федерации, который разрешил клинические испытания препарата.