Регуляция функции глюкокортикоидных рецепторов и активности ангиотензинпревращающего фермента

Центральным звеном механизма действия глюкокортикоидов являются специфические цитоплазменные глюкокортикоидные рецепторы (ГР). Их синтез программируется 1 геном хромосомы 5 [44]. Непосредственный биосинтез ГР происходит в эндоплазматическом ретикулуме цитоплазмы [12]. В цитоплазме ГР связываются с белками теплового шока (БТШ, шапероновые белки) мол. массой 50, 70, 90 кД [20, 59]. Мол. масса комплекса ГР—БТШ составляет 300 кД [14]. В отсутствие глюкокортикоидов ГР локализованы преимущественно в цитоплазме [30, 63]. В 1 клетке содержится от 5000 до 100 000 специфичечких ГР. ГР обнаружены во многих тканях млекопитающих [13], однако определенные ткани не содержат ГР: промежуточная доля гипофиза, купферовские и эндотелиальные клетки печени, почечные клубочки и проксимальные извитые канальцы [12, 31].

В физиологических условиях взаимодействие глюкокортикоида с гетероолигомером ГР приводит к диссоциации БТШ из рецепторного комплекса, активации и димеризации ГР. Ли- гандактивированный гомодимер ГР транслоцируется в ядро клетки. При этом каждая субъединица гомодимера ГР связывает по 1 молекуле глюкокортикоидного гормона. Процесс транслокации гомодимера ГР в ядро клетки контролируется специфическим механизмом, включающим сигнал для ядерной миграции внутри самого ГР и механизм в ядре, реагирующий на этот сигнал [32, 41].

Ключевым звеном в механизме действия ГР является их избирательность в регуляции активности гена, тесно связанная с первичным действием глюкокортикоид-рецепторного комплекса на хроматин, состоящий из ДНК, упакованной вместе с гистонами и другими белками в ядре клетки. Лигандактивированные ядерные гомодимеры связываются со специфическими последовательностями ДНК вблизи генов-мишеней. Эти специфические последовательности ДНК, опосредующие влияние ГР на экспрессию транскрипции, названные элементами глюкокортикоидной реакции (ЭГР), хорошо визуализируются, так как связывание ГР с ЭГР сопровождается разрывом хроматиновой структуры, вызывающим "обнажение" ДНК [20, 64]. Взаимосвязь гомодимера ГР с ЭГР ДНК инициирует транскрипцию [18]. Этот процесс тесно сопряжен со связыванием РНК-полимеразы-П с промотором ДНК, последующей дерепрессией оператора и активацией функции опе- рона в целом [11].

Механизм действия ГР на индукцию экспрессии генов тесно связан с молекулярной структурой ГР. С помощью сайт- направленного мутагенеза на уровне сДНК в молекуле ГР было обнаружено 3 функциональных домена: домен трансактивации; домен, связывающий ДНК, и домен, связывающий лиганд [29].

Домен трансактивации (аминотерминальный, N-терминальный, иммуногенный, регуляторный) является наименее консервативным. Большинство моно- и поликлональных антител к ГР распознает этот домен. Домен трансактивации прямо не взаимодействует с ДНК, однако является дополнительным вспомогательным фактором транскрипции, способствующим путем стабилизации сборки комплекса предынициации на промоторе увеличению частоты инициаций транскрипции. Эта стабилизация является результатом взаимодействия белок—белок между регуляторным фактором транскрипции (домен транскрипции) и одним фактором или более внутри комплекса предынициации [36]. На аминотерминальном конце домена ГР происходит фосфорилирование сериновых и треониновых остатков [19, 38, 52]. При этом фосфорилирование этого региона ГР увеличивается в 2—3 раза после связывания глюкокортикоида, но не антиглюкокортикоида [43]. Очевидно, что стероидзависимое фосфорилирование этого региона ГР играет важную роль в процессах транскрипции.

Домен ГР, связывающий ДНК, ответствен за специфические ДНК-связывающие активности рецептора и является наиболее консервативным. Домен проявляет функции димеризации, ядерной локализации и трансактивации. Располагается он в средней части молекулы ГР. Функция димеризации домена, связывающего ДНК, выявляется при обработке цитозольного рецептора растворами с высоким содержанием соли и в отсутствие глюкокортикоидов. При этом происходят диссоциация шапероновых белков и активация специфической ДНК-связывающей способности ГР [53]. Из этого следует, что шапероновые белки маскируют ДНК-связывающий участок ГР и таким образом блокируют взаимодействие ГР с геномом в отсутствие глюкокортикоидов. Образование димеров увеличивает сродство ГР к их соответствующим ЭГР, преимущественно благодаря увеличению размера контактирующей с ДНК поверхности. Внутри домена, связывающего ДНК, идентифицированы димеризационные взаимодействия [26, 28, 51].

Карбокситерминальный домен (С-терминальный; домен, связывающий лиганд) молекулы ГР реализует гормонсвязы- вающую функцию [38]. Эта часть молекулы ГР также содержит остатки аминокислот, которые взаимодействуют с БТШ, сигналом ядерной локализации, проявляют функции димеризации и транскрипционной трансактивации [39, 45, 57]. Ли- гандсвязывающий домен распознает специфическую трехмерную конфигурацию. Гидрофобные взаимодействия внутри ли- гандсвязывающего домена играют важную роль в связывании глюкокортикоидов. Вставки или точечные мутации в пределах этого домена разрывают связывание стероида [38].

В последнее время установлено, что ген ГР транскрибируется в 2 альтернативных сплейсинг-продукта: классический ГР_а и нелигандсвязывающий ГРр. Установлено, что /лРНК ГРр и ее рецептор экспрессируются почти во всех тканях и локализованы в цитоплазме клеток в комплексе с белками 90 кД. В присутствии глюкокортикоида ГРр гетеродимеризуется с ли- гандсвязываюшим ГР_а и транслоцируется в ядро, чтобы действовать, как доминантный отрицательный ингибитор классического ГР_О. Чрезмерная экспрессия ГРр в клетках вносит основной вклад в состояние глюкокортикоидной резистентности путем нарушения процесса димеризации рецептора и снижения трансрепрессирующей активности гетеродимеров ГР_а— ГРр по сравнению с годимодимерами ГР_а— ГР_а [15, 24, 37].

Между относительным насыщением ГР гормоном и относительной метаболической реакцией на глюкокортикоидный гормон существует корреляционная связь, свидетельствующая о том, что концентрация рецептора ограничивает величину метаболической реакции стероидного гормона. Глюкокортикоидное действие быстрообратимо. При снижении уровня стероида гормон диссоциирует из ДНК, что приводит к утрате влияния гормона на транскрипцию гена. Однако гормональная реакция, как правило, более продолжительная благодаря существованию тРНК и белков, уровни которых были повышены глюкокортикоидом. Ткани с высоким содержанием ГР обладают большей чувствительностью к действию глюкокортикоидов [17]. При этом глюкокортикоиды повышают биосинтез специфических белков-ферментов, таких как тирозинаминотрансфераза, аланинаминотрансфераза, триптофан-2,3-ди- оксигеназа, орнитиндекарбоксилаза [60]. Исключительный интерес вызывают исследования, свидетельствующие об индуцирующем действии глюкокортикоидов на активность ангио- тензинпревращающего фермента (АПФ) [21]. АПФ превращает ангиотензин 1 в ангиотензин II, который оказывает наиболее мощное по сравнению с другими известными эндогенными вазоактивными компонентами вазоконстрикторное действие. Значительная активность АПФ отмечена в клетках сосудистого эндотелия, альвеолярных макрофагах, в клетках почечных канальцев, клубочков, семенных придатков [35]. Но основная масса АПФ локализована в эндотелии сосудистой стенки, которая занимает в организме очень большую площадь [10]. Принципиально важное значение имеют данные о том, что клетки сосудистого эндотелия содержат специфический цитоплазменный ГР, который взаимодействует с глюкокортикоидом, транслоцируется в ядро этих клеток и стимулирует функцию генетического аппарата клетки, усиливая синтез специфического для этих клеток АПФ [47, 50].

Специфическая индукция АПФ под влиянием глюкокортикоидов обнаружена и в альвеолярных макрофагах. Так, дексаметазон и преднизон в пределах физиологических концентраций повышали активность АПФ в культуре альвеолярных макрофагов в 16 и 8 раз соответственно [33, 34]. Поскольку увеличение активности АПФ в культуре альвеолярных макрофагов ингибировалось актиномицином и циклогексимидом, то, следовательно, оно обусловлено транскрипцией и синтезом фермента de novo [33].

Таким образом, глюкокортикоидная индукция АПФ реализуется через глюкокортикоид-рецепторную стимуляцию функции генетического аппарата клеток, специализированных для биосинтеза АПФ. и, следовательно, активация или ингибирование ГР, особенно в клетках сосудистого эндотелия, может явиться важнейшим звеном регуляции активности АПФ, определяющего вазопрессорный эффект.

В настоящее время в качестве антигипертензивных препаратов широкое применение получили ингибиторы АПФ (ИАПФ), механизм лечебного действия которых обусловлен их ингибирующим влиянием на АПФ. Результатом ингибирования активности АПФ является снижение уровня ангиотензина II и снижение вазоконстрикторного эффекта [58].

Недавно были синтезированы непептидные антагонисты рецептора ангиотензина II, дающие выраженный антигипертензивный эффект [23]. Все это свидетельствует о важной роли ренин-ангиотензиновой системы в регуляции сосудистого тонуса.

Очевидно, что изыскание средств, блокирующих индуцирующее действие глюкокортикоидов на АПФ, является важным направлением в разработке принципов медикаментозной блокады биосинтеза ангиотензина II, снижение уровня которого сопровождается гипотензивным эффектом.

Наиболее перспективным механизмом ингибирования эффекта глюкокортикоидов на индукцию АПФ представляется фармакологическая блокада функции ГР.

Фармакологическая блокада функции ГР может быть обратимой, когда лекарственные препараты имеют близкую к глюкокортикоидам структуру и константу ассоциации с ГР. В то же время эти лекарственные препараты не дают глюкокортикоидного эффекта. За счет высоких концентраций таких лекарственных средств по закону действующих масс доступ природных и синтетических глюкокортикоидов к рецептору практически утрачивается.

Фармакологическая блокада функции истинных ГР может быть необратимой, когда лекарственные препараты вызывают конформационные изменения в рецепторной молекуле, лишая ее основной функции — взаимодействия с глюкокортикоидами [4, 62]. Функция ГР может быть блокирована и препаратами, стабилизирующими гетероолигомерный комплекс ГР [16].

Наконец, блокада функции ГР может быть опосредованной, когда лекарственные препараты повышают уровень транскортинподобных цитоплазменных белков, обладающих высокой скоростью ассоциации с природными глюкокортикоидами, намного превышающей скорость их взаимодействия с истинными ГР, и, таким образом, "обкрадывающих" истинные ГР [7]. Все эти типы фармакологической блокады функции ГР уже нашли экспериментальное подтверждение.

К числу ингибиторов, обратимо подавляющих функцию ГР, относят стероидные гормоны кортексолон, прогестерон и ряд других, получивших название антиглюкокортикоидов [3, 27]. Они способны не только ингибировать взаимодействие глюкокортикоидов с ГР, но и одновременно устранять влияние глюкокортикоидов на матричную активность ДНК [27]. Однако применение таких препаратов в клинической практике ограничено проявлением их собственного специфического гормонального эффекта. Выраженную антиглюкокортикоидную активность, опосредованную через конкуренцию с природными и синтетическими глюкокортикоидами за связывание с ГР, проявляют вновь синтезированные трансформированные стероидные соединения, содержащие 3-кето- или 3-оксигруппу в кольце А, кислородсодержащие заместители в кольце D и надстроенную 20-кетоновую цепочку. Эти соединения, подобно природным антиглюкокортикоидам, обратимо ингибируют функцию ГР [40].

Необратимую блокаду функции ГР вызывают производные фенотиазинового ряда аминазин и тизерцин [2, 4]. Они широко используются в клинической практике в качестве нейротропных и гипотензивных средств. Блокаду функции ГР вызывают ненасыщенные жирные кислоты, которые, взаимодействуя с локусом, расположенным вне специфического места связывания гормона ГР, вызывают конформационные изменения в рецепторной молекуле, лишая ее способности взаимодействия с глюкокортикоидами [62].

Аналогичный ингибирующий функцию ГР эффект обнаружен у нестероидных противовоспалительных препаратов пиразолонового и салицилового ряда. Так, анальгин и натрия салицилат дозозависимо ингибируют функцию ГР по неконкурентноми типу [7].

Кроме того, препараты пиразолонового (анальгин, амидопирин) и салицилового ряда (натрия салицилат) вызывают опосредованную блокаду ГР благодаря многократному повышению взаимодействия транскортинподобных рецепторов с глюкокортикоидами, снижая таким образом взаимодействие природных глюкокортикоидов с ГР [5, 7]. Следовательно, нестероидные противовоспалительные препараты оказывают двойное ингибирующее влияние на функцию ГР, прямое и опосредованное.

Интерес к изучению антиглюкокортикоидов резко возрос после того, как было установлено, что RU 486 (19-норстероид) связывается с высоким сродством с ГР яйцевода цыпленка [42] и является антагонистом синтеза овальбумина и кональбу- мина, индуцированного глюкокортикоидами [61]. Механизм антиглюкокортикоидного действия RU 486 обусловлен стабилизирующим действием RU 486 на гетероолигомерную форму ГР. При этом не происходит активации, димеризации и транслокации ГР в ядро. Но главное, RU 486 предотвращает взаимодействие ГР с гормончувствительным механизмом ЭГР ДНК [22]. Таким образом, подавление диссоциации шапероновых белков из гетероолигомерного рецепторного комплекса лекарственными препаратами является одним из важных механизмов ингибирования функции ГР. В отличие от RU 486 ингибирование функции ГР ненасыщенными жирными кислотами не сопровождается угнетением процесса диссоциации шапероновых белков из гетероолигомерного комплекса ГР [62].

Хотя идея использования антиглюкокортикоидов, реализующих свой эффект путем прямого или опосредованного ингибирования функции ГР, в качестве гипотензивных средств теоретически оформилась недавно, это не помешало тому, что производные фенотиазина аминазин и тизерцин, ингибирующие функцию ГР, уже давно нашли широкое применение в лечении артериальной гипертензии [8]. Недавно получены весьма убедительные данные о том, что классический гипотензивный препарат резерпин снижает уровень ГР [49] подобно аминазину и тизерцину. Это явилось важным подтверждением разрабатываемой концепции о ГР как мишени для фармакологического воздействия на внутриклеточный глюкокортикоидный эффект.

Аргументированным доказательством того, что снижение активности АПФ, а следовательно, и АД под влиянием ингибиторов функции ГР реализуется путем угнетения глюкокор- тикоид-рецепторной индукции АПФ, являются совместные исследования с А. А. Кладиевым, Н. Ю. Николаевой и К. А. Бабаян, в которых с использованием метода определения активности АПФ по субстрату фурилакрилоилфенилаланилглицилгли- цину [6] установлено, что тизерцин (3 мг/100 г) через 24 ч после внутрибрюшинного введения крысам линии Вистар достоверно снижал активность АПФ в сыворотке крови (контроль 204 ± 5 Ед/л, опыт 161 ± 8 Ед/л) и в цитозоле легких (контроль 5,95 ± 0,49 Ед на 1 мг белка, опыт 3,36 ± 0,53 Ед на 1 мг белка). Уровень активности ренина, определяемый с помощью радиоиммунного набора фирмы "Sorin" (Франция), через 24 ч после введения тизерцина резко повышался в плазме крови

(контроль 4,28 ± 0,45 нг/мл/ч, опыт 17,68 ± 0,94 нг/мл/ч; р < 0,05). Интересно, что дексаметазон (0,5 мг/100 г) через 24 ч после внутрибрюшинного введения крысам достоверно повышал активность АПФ в сыворотке крови и цитозоле легких.

Обнаруженное ингибирующее действие производных фенотиазина на активность АПФ и функцию ГР подтверждает концепцию о том, что блокада глюкокортикоидного эффекта на уровне ГР сопровождается снижением активности АПФ в ткани и сыворотке крови. Это, по-видимому, является основной причиной снижения АД при введении препаратов фенотиазинового ряда. Поскольку резерпин, подобно аминазину и тизерцину, ингибирует функцию ГР и снижает АД, то естественно полагать, что его гипотензивный эффект также реализуется через глюкокортикоид-рецепторное ингибирование АПФ. Так, резерпин (0,003 мг/100 г) через 4 ч после перорального введения крысам достоверно снижал активность АПФ в цитозоле легких (контроль 5,61 ± 0,20 Ед на 1 мг белка, опыт 4,80 ± 0,21 Ед на 1 мг белка).

До последнего времени гипотензивный эффект производных фенотиазина и резерпина связывался исключительно с ингибированием функции адренорецепторов сосудистой стенки [8]. Новые данные о влиянии этих препаратов на функцию ГР существенно расширяют представления о механизме действия производных фенотиазина и резерпина. Можно полагать, что гипотензивный эффект производных фенотиазина и резерпина является результатом комплексного воздействия на адренорецепторы и ГР клеток сосудистого эндотелия. Об этом свидетельствует тот факт, что биосинтез АПФ клетками сосудистого эндотелия усиливается не только глюкокортикоидами, но и цАМФ [21], концентрация которого повышается под влиянием катехоламинов. Однако эффект катехоламинов усиливается при пермиссивном действии глюкокортикоидов [9], что указывает на доминирующую роль глюкокортикоидов в реализации эффекта не только катехоламинов, но и ряда пептидных гормонов, осуществляющих свое метаболическое действие через аденилатциклазный механизм [11].

Механизм пермиссивного эффекта глюкокортикоидов на метаболическое действие катехоламинов в клетках гладких мышц обусловлен тем, что глюкокортикоиды более чем в 2 раза повышают синтез адренергических рецепторов de novo [25, 46, 55].

Нельзя не отметить, что хронизация стресс-реакции, характеризующаяся повышенным содержанием глюкокортикоидов в организме, является важнейшей причиной продолжительной индукции АПФ, прежде всего в клетках сосудистого эндотелия. Хотя о роли нервно-психического стресса в развитии артериальной гипертензии было известно давно, однако конкретные пути реализации нервно-психического стресса, центральным звеном которого являются глюкокортикоиды, в патогенезе артериальной гипертензии нашли свое отражение в глюкокортикоид-рецепторной индукции АПФ. В свете этого по-новому представляются пути профилактики и лечения нервно-психического стресса и хронизации соматического стресса и артериальной гипертензии.

На первый взгляд, представляется, что ИАПФ и антиглюкокортикоиды, ингибирующие функцию ГР, существенно не отличаются между собой по действию на АПФ. И те и другие снижают ферментную активность АПФ. Однако если ИАПФ прямо ингибируют активность фермента, то антиглюкокортикоиды ингибируют процесс биосинтеза АПФ. Различия в механизме снижения активности АПФ имеют принципиальное значение, так как обосновывают целесообразность сочетанного применения ИАПФ и антиглюкокортикоидов, ингибирующих функцию ГР, для более полной блокады активности АПФ. В клинической практике с этой целью уже используется резерпин в сочетании с ИАПФ при лечении артериальной гипертензии [1].

С патофизиологической точки зрения очевидно, что ИАПФ не устраняет основную причину, вызывающую гиперпродукцию АПФ в клетках сосудистого эндотелия — повышенную функцию ГР, индуцирующих биосинтез АПФ. Антиглюкокортикоиды (производные фенотиазина и резерпин) наряду с ингибированием глюкокортикоид-рецепторной индукции АПФ в клетках сосудистого эндотелия одновременно ингибируют глюкокортикоид-рецепторную индукцию специфических белков клеток сосудистого эндотелия с мол. массой 43 и 28 кД, принимающих участие в регуляции сосудистого тонуса [54, 56]. Кроме того, антагонисты глюкокортикоидных рецепторов (кортизол-21-месилат) дерепрессируют ингибированный глюкокортикоидами биосинтез вазодилататора простациклина в клетках сосудистого эндотелия [48]. Таким образом, антиглюкокортикоиды оказывают более адекватное влияние на механизмы прессорной реакции, чем ИАПФ.

Следует подчеркнуть, что глюкокортикоид-рсцепторный механизм регуляции сосудистого тонуса наконец-то можно рассматривать на уровне 2 важнейших регуляторных систем — гормональной и ренин-ангиотензиновой, что, естественно, расширяет возможности фармакологической регуляции сосудистого тонуса. Однако перспективы использования ГР как мишени для фармакологической регуляции внутриклеточного метаболизма при патологических состояниях не исчерпываются сердечно-сосудистой системой. Они неизмеримо шире, что и определяет настоятельную необходимость дальнейшего развития этого направления.