Гепоксилины - активаторы АТФ-зависых К+-каналов В-клеток поджелудочной железы в норме и при патологии

Секреция инсулина из р-клеток поджелудочной железы, специфическим стимулятором которой являются глюкоза и продукты ее метаболизма, определяется состоянием АТФ-зависимых К⁺-каналов [1, 2, 4, 5, 7]. Глюкоза вызывает деполяризацию клеточной мембраны р-клеток за счет притока Са²⁺ и его накопления в цитозольной фракции, вызывая тем самым запуск секреции инсулина. Аналогичным образом действуют и сульфаниламидные препараты, широко используемые в лечебной практике диабета II типа (ин- сулиннезависимого) [9, 10, 14—16].

Обнаружение нового класса соединений — ге- поксилинов, являющихся продуктами метаболических превращений арахидоновой кислоты в островках Лангерганса, а также их способности к стимуляции секреции инсулина вызвало интерес у специалистов-эндокринологов с точки зрения их применения в клинической практике при лечении инсулиннезависимого диабета [6, 12, 13]. Однако в литературе практически отсутствуют данные, расшифровывающие механизм действия гепокси- линов.

Целью нашего исследования было оценить состояние АТФ-зависимых К⁺-каналов р-клеток поджелудочной железы и охарактеризовать их реакцию в ответ на введение гепоксилина НхВ₃ на интактных клетках и на клетках, частично пораженных под влиянием различных доз стрептозотоцина.

Основным методом исследования в нашей работе был метод ”пэтч-клампф", позволяющий оценивать активность отдельных каналов в условиях регистрации от целой клетки [8, 11].

Материалы и методы

Работа проведена на культуре островковых клеток поджелудочной железы крыс. Выделение и культивирование клеток проводили по ранее описанному методу S. Misler и соавт. [И]. Клетки высевали на 35-миллиметровые пластиковые чашки Петри со средой RPMI и выдерживали минимум 24 ч при 37°С в атмосфере с 5% СО2 с целью прикрепления их ко дну. Перед началом электрофизиологических исследований в культуральную среду добавляли стрептозотоцин в различных концентрациях (1, 2, 5 ммолей), растворенный в цитратном буфере. Этот препарат подавали в камеру с помощью локальной микроперфузии. Время воздействия составляло 30 мин, после чего проводили отмывание и дальнейшую инкубацию. В инкубате до и после воздействия стрептозотоцина определяли концентрацию инсулина, что и было показателем степени поражения [3-клеток. Для проведения электрофизиологических анализов культуральную среду меняли на изотонический раствор, который содержал 140 мМ NaCl, 1 мМ СаС1₂, 2 мМ MgCl₂, 2,8 мМ КС1, 10 мМ HEPES pH 7,4. Стеклянные микропипетки заполняли изотоническим раствором, имитирующим состав цитоплазмы: 140 мМ КС1, 10 мМ HEPES, 3 мМ MEGTA, 0,5 мкМ СаС1₂, 2 мМ MgCl₂ pH 7,4. Пипетки имели сопротивление около 5 МОм и подсоединялись к усилителю ЕРС-5 ("LIST Electronic", ФРГ). В эксперименте использовали только одиночные клетки. Интеграционные токи регистрировали с помощью усилителя, имеющего цепи компенсации емкостных переходных процессов. Ионные токи регистрировали на запоминающем осциллографе и магнитографе. В ходе опыта подсчитывали среднее число каналов, открытых в фиксированной части клеточной мембраны. Анализ кинетических процессов проводили с момента регистрации, когда был активен только 1 канал [8, 9]. После этого составляли гистограммы, которые отражали суммарный эффект действия того или иного препарата на функционирование отдельно анализируемого ионного канала. Идентификацию АТФ-зависимых К⁺-кана- лов проводили с помощью избирательной блокады других каналов Na⁺ и Са²⁺ тетрадоксином и хлоридом кадмия. Все эксперименты проводили при комнатной температуре. Исследуемый препарат — гепоксилин — добавляли непосредственно во внеклеточный раствор. Всего было проанализировано 56 клеток, потенциал покоя которых в среднем составлял 59,8 ± 1,7 мВ.

Результаты и их обсуждение

7. Электрофизиологическая оценка состояния АТФ- чувствителъных -каналов $-клеток, функционально ослабленных под влиянием стрептозотоцина.

В I серии исследований нами была проведена идентификация АТФ-чувствительных К⁺-кана- лов к глюкозе в фиксированных мембранах клеток. Каналы интактных клеток характеризовались устойчивой величиной потенциала покоя, который колебался в пределах 60—62 мВ. Популяция этих каналов закрывалась через 2—5 мин после начала перфузии клеток раствором, содержащим 5—10 мМ глюкозы. Закрытие каналов сопровождалось началом спайковой активности клеток, открывались же они вновь через 2—5 мин после отмывания глюкозы, и это повторное открытие совпадало с исчезновением спайковой активности. Каналы не проявляли значительных вариаций по своей величине потенциала покоя, максимальная величина которого была в пределах + 100 мВ.

Аналогичные исследования на р-клетках, предварительно перфузируемых различными дозами стрептозотоцина, показали сниженную функциональную активность. Электрофизиологически это выражалось в снижении величины потенциала покоя на 10—25 мВ в зависимости от степени поражения. Наиболее демонстративными были изменения исследованных нами показателей после перфузии 2 мМ стрептозотоцина. Период закрытия каналов после воздействия на эти клетки раствора, содержащего 5—10 мМ глюкозы, задерживался и составлял 5—7 мин (в контроле 2—5 мин). Это приводило к удлинению латентного периода возникновения спайковой активности. Аналогичную картину наблюдали и после отмывания глюкозы: необходимо было 6—7 мин, чтобы вновь произошло открытие каналов и исчезла спайковая активность.

2. Функциональная оценка состояния АТФ-чув- ствителъных К*-каналов fi-клеток, частично пораженных стрептозотоцином, под воздействием гепоксилина НхВ₃

В таблице представлены полученные результаты исследований по анализу ряда электрофизиологических показателей состояния АТФ-зависимых К⁺-каналов интактных и функционально-ослабленных стрептозотоцином р-клеток после аппликации глюкозы и гепоксилина. Наиболее типичной реакцией исследуемых каналов в этих экспериментальных условиях было их полное закрытие под влиянием испытуемых веществ. Однако в отличие от интактных клеток для достижения аналогичного эффекта необходимы были дозы в 2,5—3 раза выше. Процесс закрытия канала происходит значительно медленнее, чем в норме, достигая устойчивого состояния в течение 35—55 с, и длится такой эффект до 12—14 мин. Отмывание культуры восстанавливало активность этих каналов до исходного уровня, однако этот процесс шел очень инерционно.

Сравнительный анализ действия глюкозы и гепоксилина показал, что гепоксилин в концентрации 10 мМ способен стимулировать секрецию инсулина. Это подтверждается данными, свидетельствующими о более быстрых темпах закрытия каналов, и началом возникновения спайковой активности. Эти показатели обычно отражают деполяризацию клеточной мембраны и возникновение потенциала действия, вслед за которым происходит вхождение ионов кальция внутрь клетки; совместно со свободным кальцием в цитозоле они достигают необходимого уровня для активации экзоцитоза секреторных гранул инсулина.

Влияние глюкозы и гепоксилина НхВ₃ на некоторые электрофизиологические показатели АТФ-зависимых К⁺ -каналов интактных р-клеток, а также р-клеток, функционально-ослабленных под воздействием стрептозотоцина (2 мМ)

В предыдущих исследованиях [1, 2] по расшифровке механизма действия сульфаниламидных препаратов как на интактных, так и на функционально-ослабленных р-клетках показано, что эти препараты оказывают специфическое действие на характер биоэлектрической активности АТФ-зависимых К⁺-каналов, точнее, на временный характер ее распределения. Обычно активность анализируемых нами каналов проявляется пачковыми разрядами стандартной амплитуды, чередующимися с паузами длительностью несколько секунд. Структура биоэлектрической активности АТФ-зависимых К⁺-каналов р-клеток со сниженной активностью не менялась. Добавление гепоксилина вызывало сокращение длительности разрядов с одновременным увеличением интервала между пачками. Аналогичный эффект наблюдали и после добавления глюкозы.

Детальный анализ динамики протекающих в ионном канале процессов, таких как средняя продолжительность закрытия канала в пачковом разряде, средняя продолжительность интервала в разряде, как наиболее типичных и информативных показателей при оценке действия стрептозотоцина, показал следующие результаты (см. таблицу). Добавление стрептозотоцина в дозе 2 мМ приводит к снижению средней продолжительности разряда на 15% от исходной, а продолжительность интервала между пачками сокращается на 29%. Снижаются продолжительность времени открытия на 4,5%, а также средняя продолжительность интервала в разряде на 25%. Эти данные свидетельствуют о том, что р-клетки в наших экспериментальных условиях, несмотря на снижение используемых нами электрофизиологических показателей, сохраняют свою функциональную активность. Об этом также свидетельствуют данные ответной реакции пораженных р-клеток на введение глюкозы. Так, добавление 3,2 мМ глюкозы сокращает время открытия канала на 8,8% от исходного, а средняя продолжительность интервала в разряде уменьшается на 8%. Средняя продолжительность разряда сокращается в 3 раза, а интервал между пачками увеличивается в 8 раз. Это свидетельствует о специфической ответной реакции функционально-ослабленных р-клеток на введение глюкозы, наиболее четко проявляющейся в сниженной способности каналов к открытию за счет сокращения длительности разрядов и увеличения продолжительности интервала между ними.

Аналогичные результаты получены нами в опытах с аппликацией гепоксилина. Добавление 10 мМ гепоксилина к р-клетке, частично пораженной стрептозотоцином, вызывало снижение показателей возможности открытия канала на 25—28%, время открытия уменьшалось на 13—15%, средняя продолжительность разряда сокращалась в 3,5 раза, а продолжительность межимпульсных интервалов увеличивалась в 2,5 раза.

Полученные нами данные свидетельствуют о том, что АТФ-зависимые К⁺-каналы р-клеток после воздействия стрептозотоцина сохраняют в основном свои функциональные свойства и способны адекватно реагировать на специфические раздражители, какими являются глюкоза и гепоксилин. Следует обратить внимание на факт более медленного закрытия АТФ-зависимых К⁺-кана- лов и тем самым увеличения латентного периода секреции инсулина начиная с момента воздействия глюкозы и гепоксилина до экзоцитоза кванта инсулина. Процесс приобретает более инерционный характер. В этом случае нельзя исключить нарушения внутриклеточного метаболизма р-кле- ток, способных привести и к нарушениям их структуры. Хорошо известно, что добавление АТФ в культуру клеток быстро восстанавливает активность АТФ-чувствительных К⁺-каналов, которые являются стратегически важной точкой в реализации эффекта гепоксилина в системе стимул — секреция.

Вышеприведенные данные подтверждают также результаты, полученные В. П. Федотовым и соавт. [3], которые на изолированных культивируемых клетках аденогипофиза, островков Лангерганса и гепатоцитах крыс исследовали влияние эпимеров гепоксилина НхВ₃ на секрецию пролактина, инсулина и альбумина соответственно. Показано, что оба эпимера НхВ₃ стимулируют секрецию инсулина в культуре островковых клеток и накопление иммунореактивного альбумина в среде культивируемых гепатоцитов. Отмечено ингибирующее действие НхВ₃ в отношении пролактина. Инсулинотропное действие НхВ₃ осуществляется при физиологических концентрациях глюкозы, а также в среде, не содержащей глюкозы, что может служить доказательством прямого действия гепоксилинов на секрецию инсулина, а ионные каналы являются ответственными за проявление прямого фармакологического действия на процессы электрогенеза, приводящие к секреции инсулина р-клетками. Весьма серьезным показателем, отмеченным нами, является то, что как глюкоза, так и гепоксилин НхВ₃ оказывают обратимое влияние на функционирование каналов. Наблюдаемые нами эффекты снимались после отмывания активного начала.

Вопрос, поставленный нами в изучении особенностей функционирования ионных каналов в р-клетках, частично ослабленных под влиянием стрептозотоцина, весьма актуален для специали- стов-диабетологов при выборе препаратов для терапии конкретного больного диабетом II типа. Еще более актуальным следует считать вопрос о возможном использовании препаратов гепоксилина в чистом виде или в сочетании с введением глюкозы или сульфаниламидных препаратов для лечения больных диабетом II типа. Наши поисковые исследования в этом отношении создают благоприятный фон для серьезных клинических испытаний эффекта действия гепоксилинов.

Выводы

1. АТФ-зависимые К⁺-каналы р-клеток поджелудочной железы (как интактных, так и функционально-ослабленных под влиянием стрептозотоцина) проявляют специфическую реакцию под действием глюкозы и гепоксилина НхВ₃.
2. Гепоксилин НхВ₃ обладает свойством прямого влияния на функцию инсулинсекретирую- щих клеток через АТФ-зависимые К⁺-каналы Р-клеток. Dunne M. J., Jllot F. C., Peterson 0. J. // Membr. Biol.— 1987. - Vol. 99. - P. 215-224.