Связывание пролактина в сыворотке крови при различных формах гиперпролактинемии

Гиперпролактинемия может быть обусловлена многими причинами, среди них опухоли гипофиза, длительный прием препаратов, стимулирующих секрецию пролактина (ПРЛ), гипотиреоз и др. Значительное место в этом ряду занимает идиопатическая гиперпролактинемия, непосредственные

причины возникновения которой установить не удается. Вероятнее всего, идиопатическая гиперпролактинемия гетерогенна и включает разные по происхождению и характеру развития состояния.

Несколько лет назад в сыворотке крови отдельных больных с идиопатической гиперпролактинемией были обнаружены аутоантитела к ПРЛ [7, 8], причем у таких больных не было типичных клинических признаков гиперпролактинемии — галакто- реи и аменореи. Как показано ранее в наших [1,3] и других исследованиях [4, 6], характерные клинические проявления гиперпролактинемии могут отсутствовать при преобладании в крови высокомолекулярного иммунореактивного ПРЛ (ирПРЛ). Природа этой формы сывороточного ПРЛ до последнего времени остается неясной. Одна из возможностей формирования высокомолекулярного ирПРЛ состоит в связывании гормона с антипролактиновыми иммуноглобулинами.

Задачей настоящей работы явилось изучение у значительной группы пациенток с гиперпролактинемией различного генеза связывания ПРЛ, меченного ¹²⁵1, иммуноглобулинами сыворотки крови с целью установления присутствия и частоты втречаемости аутоантител к ПРЛ при отдельных формах гиперпролактинемии, с одной стороны, и поиска корреляции между наличием аутоантител и высокомолекулярным ирПРЛ в крови, с другой.

Материалы и методы

Исследовали сыворотки крови 112 женщин с гиперпролактинемией различного генеза и 45 женщин с нормопролактинемией без признаков эндокринной патологии. Группу пациенток с гиперпролактинемией составляли 12 беременных (физиологическая гиперпролактинемия), 65 больных с опухолями гипофиза и 38 женщин с идиопатической гиперпролактинемией. Уровень ПРЛ в сыворотках крови у этих пациенток варьировал от 700 до 164 000 мкЕ/мл при опухолях гипофиза, от 650 до 3200 мкЕ/мл при идиопатической гиперпролактинемии и от 3690 до 6800 мкЕ/мл при беременности.

Высокоочищенный ПРЛ человека для изучения связывания и радиоиммунологического анализа йодировали с помощью йодогена [9]. Связывание [¹²⁵1]-ПРЛ иммуноглобулинами в сыворотках крови определяли методом, основанным на осаждении иммунных комплексов 12,5% полиэтиленгликолем-6000 (ПЭГ-6000) [7, 8], с некоторыми модификациями. Как было показано методом иммунопреципитации с использованием специфических антител к различным иммуноглобулинам человека, ПРЛ-связывающий компонент сывороток крови является иммуноглобулином G [7]. Реакционная смесь для анализа связывания меченого ПРЛ в сыворотке крови состояла из 50 мкл 0,05М натрийфосфатного буфера pH 7,5 с добавлением 0,5% бычьего сывороточного альбумина и 0,01% мер- тиолата (буфер инкубации), 50 мкл сыворотки крови и 15—20 тыс. имп/мин [¹²⁵1]-ПРЛ в 50 мкл буфера инкубации. При необходимости добавляли различное количество немеченого ПРЛ (0,1 — 10 мкг в 50 мкл буфера инкубации). Пробы инкубировали в течение 1 ч при 37°С. По окончании инкубации к реакционной смеси добавляли 150 мкл 25% ПЭГ-6000, пробы тщательно перемешивали, выдерживали 15 мин при 4°С и центрифугировали 30 мин со скоростью 3000 об/мин. Надосадочную жидкость удаляли, осадок взмучивали в 150 мкл буфера инкубации и переосаждали равным объемом 25% ПЭГ-6000. Радиоактивность осадков после промывания измеряли на гамма-спектрометре. О связывании меченого ПРЛ судили по доле радиоактивности в материале, осевшем в этих условиях, в процентах от общего количества добавленной метки.

Гель-фильтрацию сывороток крови проводили на колонке сефадекса G-100 ("Pharmacia”, Швеция), как описано ранее [1]. Связывание [¹²⁵1]-ПРЛ во фракции ирПРЛ с высокой молекулярной массой, элюировавшейся в свободном объеме колонки, измеряли тем же методом, что и в цельных сыворотках крови. Для проведения этого исследования лиофилизированные фракции высокомолекулярного ирПРЛ растворяли в минимальном объеме буфера инкубации. Содержание ирПРЛ в сыворотках крови и фракциях с колонки определяли ра- диоиммунологическим методом с помощью тест-системы, разработанной в лаборатории и откалиброванной по международному стандарту ПРЛ 84/500.

Результаты и их обсуждение

Результаты исследования связывания [¹²⁵1]-ПРЛ в сыворотках крови женщин с нормопролактинемией и гиперпролактинемией различного генеза представлены на рис. 1. У 45 человек без признаков эндокринной патологии с нормальным содержанием ПРЛ в сыворотке крови процент [¹²⁵1]-ПРЛ, осаждавшегося в присутствии ПЭГ, составлял 6,5 ±1,3 (М ± о). Ни у одной женщины с физиологической гиперпролактинемией (беременность) этот показатель не превышал 6,5 ± 2сг. То же самое имело место и при опухолях гипофиза. Однако из 38 женщин с идиопатической гиперпролактинемией у 9 связывание [¹²⁵1]-ПРЛ в сыворотке крови превышало средний показатель при нормопролактине- мии более чем на величину 2о, а у 6 женщин — в 2—3 раза. Процент связанного меченого ПРЛ существенно снижался при добавлении в реакционную смесь избытка немеченого гормона. Вытеснение меченого ПРЛ немеченым продемонстрировано на рис. 2, а на примере сывороток крови 2 женщин с идиопатической гиперпролактинемией (сыворотки № 1 и 2).

а                       6                   в                    z

Рис. 1. Связывание [¹²⁵1]-ПРЛ в сыворотках крови при гиперпролактинемии различного происхождения.

а — идиопатическая гиперпролактинемия; б — опухоли гипофиза; в — физиологическая гиперпролактинемия; г — нормопролактинемия.

Здесь и на рис. 2 и 3 по оси ординат — содержание |¹²⁵Ц-ПРЛ, осаждаемого в присутствии ПЭГ (в %).

ного гормона.

а — сыворотки крови 2 женщин (№ 1 и 2) с идиопатической гиперпролактинемией; б — фракции высокомолекулярного ирПРЛ, полученные из тех же сывороток. Светлые столбики — инкубация без добавления немеченого ПРЛ, заштрихованные — инкубация в присутствии избытка немеченого ПРЛ.

Таким образом, изучение связывания [ ¹²⁵1]-ПРЛ в сыворотках крови при различных формах гиперпролактинемии по сравнению с контрольными нормопролактинемическими сыворотками показало, что среди 38 сывороток крови женщин с идиопатической гиперпролактинемией 24% сывороток проявляли повышенную способность связывать меченый гормон с образованием комплекса, осаждаемого в присутствии ПЭГ. Связанный меченый ПРЛ вытеснялся немеченым, т. е. связывание носило обратимый и специфический характер. Эти результаты свидетельствуют о наличии в данных сыворотках ПРЛ-связывающих иммуноглобулинов, иначе говоря, антипролактиновых аутоантител. В отличие от идиопатической гиперпролактинемии при физиологической гиперпролактинемии вследствие беременности, а также при гиперпролактинемии, возникающей при опухолях гипофиза, аутоантитела к ПРЛ в крови не выявлены.

В результате исследования соотношения форм ирПРЛ с высокой и низкой молекулярной массой в сыворотках крови пациенток с гиперпролактинемией, проведенного нами ранее [3], установлено, что по меньшей мере у 6 из 9 описанных выше женщин с идиопатической гиперпролактинемией в крови преобладал высокомолекулярный ирПРЛ. У остальных 3 женщин исследование соотношения форм ирПРЛ с разной молекулярной массой не проводили из-за недостатка сыворотки для такого рода анализа.

В связи с предположением о том, что высокомолекулярный ирПРЛ сыворотки крови может представлять собой комплекс мономера гормона, со специфическими иммуноглобулинами, было изучено связывание [ ¹²⁵1]-ПРЛ во фракциях сывороточного высокомолекулярного ирПРЛ, полученных методом гель-фильтрации через сефадекс G-100. На рис. 2, б приведены данные о связывании [¹²⁵1]-ПРЛ во фракциях высокомолекулярного ирПРЛ из сывороток крови 2 женщин с идиопатической гиперпролактинемией. Относительное содержание высокомолекулярного ирПРЛ в одной из сывороток (№ 1) достигало 96%, а в другой (№ 2) — 87% суммарного ирПРЛ. Связывание метки во фракции высокомолекулярного ирПРЛ из сыворотки крови- № 1 составило 35%, а из сыворотки № 2 — 19,5%. Связывание меченого ПРЛ, как и в случае нефракционированных сывороток крови тех же женщин, было специфичным. Оно подавлялось как избытком (рис. 2, б), так и дозозависимо различными количествами (рис. 3) немеченого ПРЛ. Подобного специфического связывания не обнаружено во фракциях высокомолекулярных белков, полученных из сывороток крови больных с низким содержанием высокомолекулярного ирПРЛ.

Таким образом, приведенные данные, с одной стороны, свидетельствуют о том, что наличие в сыворотках крови антипролактиновых аутоантител, как правило, сочетается с преобладанием в этих же сыворотках высокомолекулярной формы ирПРЛ, с другой стороны, они показывают, что фракция высокомолекулярного ирПРЛ может содержать значительное количество иммуноглобулинов, специфически связывающих ПРЛ. Это подтверждает справедливость предположения о том, что высокомолекулярный ирПРЛ, обнаруживаемый в сыворотке крови в качестве преобладающей формы гормона, может формироваться за счет связывания ПРЛ с антипролактиновыми аутоантителами.

Причины и последствия выработки специфических аутоантител к ПРЛ пока неясны, однако возможность их существования необходимо учитывать при диагностике и выработке тактики лечения гиперпролактинемических состояний. Уже отмечалось, что классические клинические проявления гиперпролактинемии у лиц со значительным содержанием высокомолекулярного ирПРЛ или антипролактиновых аутоантител в крови отсутствуют или выражены слабо. Причиной этого может быть пониженная биологическая активность гормона, связанного с иммуноглобулинами, по сравнению со свободным. Исследование, проведенное нами на культурах клеток NB2 лимфомы [2], несущих лактогенные рецепторы, показало, что пролиферативная активность сывороточного высокомолекулярного ирПРЛ в этих культурах существенно ниже активности ирПРЛ с низкой молекулярной массой, соответствующей мономеру гормона. Возможность присутствия антипролактиновых ауто-

0,7              0,25        2,0            10,0

Рис. 3. Зависимость связывания [¹²⁵1]-ПРЛ от концентрации немеченого ПРЛ при инкубации с фракцией высокомолекулярного ирПРЛ.

По оси абсцисс — концентрация немеченого ПРЛ (в нг/мл; логарифмическая шкала). антител в крови заставляет по-новому подойти к оценке происхождения и значения идиопатической гиперпролактинемии. Специфические иммуноглобулины могут связывать значительное количество ПРЛ. При этом его содержание в крови может повышаться за счет увеличения периода полужизни связанного гормона. Возможно, в связанной форме он не участвует в ауторегуляторных механизмах обратной связи, что приводит к гиперсекреции гормона гипофизом. С другой стороны, аутоантитела могут сами по себе имитировать присутствие ПРЛ в иммуноаналитических тест-системах, а также вмешиваться в биологические эффекты гормона, связываясь с его рецепторами в тканях-мишенях. С учетом этих соображений возникает вопрос о целесообразности проведения традиционной терапии, подавляющей секрецию ПРЛ, у пациентов с идиопатической гиперпролактинемией и антипрол актиновыми аутоантителами в крови.

В заключение следует отметить, что в результате проведенного исследования установлено присутствие в циркулирующей крови у части пациентов с гиперпролактинемией неясного происхождения аутоантител к ПРЛ, что проливает свет на одну из возможных причин идиопатической гиперпролактинемии. В то же время результаты проведенного исследования позволяют сделать заключение о природе высокомолекулярного ирПРЛ, который, вероятно, представляет собой комплекс ПРЛ со специфическим иммуноглобулином. В связи с обнаружением в крови антипролактиновых аутоантител возникает необходимость изучения при идиопатической гиперпролактинемии причин и механизмов развития аутоиммунного процесса. Нельзя исключить, что образование аутоантител к ПРЛ может быть не только следствием аутоиммунных нарушений, но и неким физиологическим механизмом, регулирующим в определенных условиях функции ПРЛ в организме. Недавно иммуноглобулины, специфически связывающие ПРЛ, были с высокой достоверностью идентифицированы в сыворотках крови овариэктомированных самок крыс, получавших эстрадиол, а также здоровых женщин, принимавших контрацептивные препараты, и женщин в III триместре беременности [5].

Выводы

1. В результате изучения связывания ПРЛ, меченого ¹²⁵1, в сыворотках крови женщин с различными формами гиперпролактинемии установлено, что часть (24%) женщин с идиопатической гиперпролактинемией имеют в крови антипролактино- вые аутоантитела.
2. В отличие от идиопатической гиперпролактинемии при физиологической гиперпролактинемии у беременных женщин, а также при гиперпролактинемии опухолевого генеза присутствия в крови аутоантител к ПРЛ не обнаружено.
3. Полученные данные указывают на то, что одной из причин идиопатической гиперпролактинемии может быть присутвие в циркулирующей крови антипролактиновых аутоантител.
4. Преобладание в крови высокомолекулярной формы иммунореактивного ПРЛ может быть обусловлено связыванием значительного количества мономера ПРЛ с антипрол актиновыми аутоантителами.