Одновременное исследование содержания кортикостерона и 11-дегидрокортикостерона в надпочечниках и плазме крови при остром стрессе

Кортикостерон является основным глюкокортикоидом у крыс, а 11-дегидрокортикостерон (вещество А по классификации Т. Рейхштейна) - его обратимым метаболитом. Взаимопревращение этих гормонов осуществляется ферментом 11[3-ок- систероиддегидрогеназой (ЕС 1.1.1.146).

Существуют 2 изоформы этого фермента. Первая изоформа (НАДФ-зависимая) катализирует преимущественно реакцию восстановления И-дегидрокортикостерона в кортикостерон. Эта изоформа солокализована с глюкокортикоидными рецепторами различных тканей. Ее активность индуцируется глюкокортикоидами по механизму положительной обратной связи [3]. У самцов крыс активность этой изоформы фермента в печени в 2 раза выше, чем у самок, так как эстрогены подавляют транскрипцию ее гена в печени самок [6]. Активность этой изоформы фермента повышается при хроническом стрессе [5, 6].

В надпочечниках крыс эта изоформа фермента локализована преимущественно в кортикальных клетках, пограничных мозговому слою, и играет важную роль в регуляции биосинтеза адреналина, создавая высокую концентрацию кортикостерона в мозговом слое надпочечника.

Вторая изоформа (НАДН-зависимая) катализирует реакцию окисления, тем самым превращая кортикостерон в относительно неактивный И-дегидрокортикостерон [15]. Данная изоформа фермента у крыс обнаружена в классических тканях- мишенях альдостерона (мозг, почки, слюнные железы, кишечник, сосуды), где она солокализована с минералокортикоидными рецепторами, в женской репродуктивной системе, в клетках Лейдига [10, 12, 14], т. е. в тех тканях, где необходима инактивация избытка глюкокортикоидов, а также в коре надпочечников, где она в отличие от 1-й изоформы распределена примерно одинаково во всех зонах и имеет микросомальную, внутриядерную и митохондриальную локализацию, тогда как 1-я изоформа - только микросомальную. Наибольшее содержание 2-й изоформы фермента встречается в надпочечниках самцов крыс [13]. Активность этой изоформы ингибируется продуктом реакции -11- дегидрокортикостероном [7].

Существует и неконкурентное ингибирование активности 2-й изоформы фермента, осуществляемое вторичными посредниками рецепторов АКТГ [8]. Показано также, что при повышении концентрации АКТГ в крови крыс происходит уменьшение конверсии кортикостерона в И-дегидрокортикостерон в сетчатой и пучковой зонах коры надпочечников [2]. В интактных условиях перфузаты надпочечников крыс выделяют в инкубационную среду значительное количество 11-дегидрокортикостерона, тогда как при введении АКТГ наблюдали значительное увеличение отношения кортико- стерон/11-дегидрокортикостерон в пучковой зоне, увеличение секреции кортикостерона и значительное уменьшение выделения 11-дегидрокортикостерона [9].

Таким образом, наличие двух изоформ фермента и характер их регуляции, секреция И-дегидрокортикостерона надпочечниками свидетельствуют о значимости исследования содержания этого вещества при различных состояниях организма.

Целью настоящей работы явилось одновременное исследование содержания кортикостерона и 11-дегидрокортикостерона в плазме крови и надпочечниках интактных крыс и изменения этих показателей при остром стрессовом воздействии.

Материалы и методы

Исследование влияния острого стрессового воздействия проведено на крысах-самках линии Вистар 5-месячного возраста. Подопытных животных подвергали лапаротомии под нембуталовым наркозом (40 мг/кг, внутрибрюшинно) после предварительного рауш-наркоза. Общее время нахождения крыс под наркозом составило 70 мин. Контролем служили интактные животные того же возраста. Оперативная подготовка выполнена сотрудниками центральной научно-исследовательской лаборатории Новосибирского медицинского института под руководством Г. Н. Шориной.

Кровь и оба надпочечника забирали у всех животных после декапитации. Кровь собирали в гепаринизированные пробирки, центрифугировали 15 мин при 4000 об/мин при 4°С. Плазму отделяли

Содержание кортикостерона и 11-дегидрокортикостерона в плазме крови и надпочечниках интактных и подопытных животных

Интактные (л = 8)           588,0 ± 32,0           1167,8 ± 234,9          37,9 ± 5,6              99,0 ± 20,9                19,7 ± 2,8               11,9 ± 1,4

Подопытные (л = 10)      1141,0 ± 117,0*     1169,3 ± 146,6          56,0 ± 13,0            182,8 ± 26,4*           30,9 + 8,9*             7,5 ± 1,1*

Примечание. Звездочка - достоверные (р < 0,05) отличия относительно интактных животных.

и либо немедленно анализировали, либо хранили до дня анализа при -20°С. Концентрацию кортикостерона и 11-дегидрокортикостерона в плазме крови определяли методом микроколоночной высокоэффективной жидкостной хроматографии на хроматографе "Милихром-1" (НПО "Научприбор", г. Орел) [1].

Надпочечники отделяли от жировой ткани, взвешивали на торсионных весах ВТ-500. Каждый надпочечник переносили в индивидуальный стеклянный гомогенизатор, находящийся в ледяной ванне. Затем в гомогенизатор добавляли 2,5 мл охлажденного ацетона (ч.д.а.) и тщательно растирали в течение 1 - 1,5 мин до полного измельчения ткани. Для анализа использовали 8 мкл гомогената. Затем его подвергали той же хроматографической процедуре, что и плазму крови.

Результаты и их обсуждение

У интактных животных уровень кортикостерона в плазме крови составил 588,0 ± 32,0 нг/мл, уровень 11-дегидрокортикостерона - 37,9 ± 5,6 нг/мл (см. таблицу). Первое значение согласуется с данными о содержании кортикостерона в плазме крови крыс-самцов линии Вистар, также полученными методом высокоэффективной жидкостной хроматографии [4]. Мы обращаем внимание на это замечание, так как в подавляющем большинстве опубликованных работ исследование кортикостерона в крови крыс проводится неселективными способами (флюориметрический, радиоиммунный, иммуноферментный, метод конкурентного белкового связывания), сравнение с которыми не имеет смысла. Что касается уровня 11-дегидрокортикостерона, то в литературе нет сведений о его исследовании в крови крыс или других лабораторных животных.

В клинической практике используется коэффициент кортизол/кортизон [11], изменения которого отражают функциональное состояние глюкокортикоидной системы. Поэтому представляло интерес оценить отношение кортикостерон/11-дегидрокортикостерон у крыс. Оно составило у интактных животных 19,7 ± 2,8. По данным нашей лаборатории, коэффициент кортизол/кортизон в сыворотке крови здоровых лиц равен 4,34 ±0,1. Таким образом, у крыс по сравнению с людьми уровень ведущего глюкокортикоида в плазме крови значительно превышает уровень его обратимого метаболита.

Суммарное содержание кортикостерона в надпочечниках интактных животных составило в среднем 1167,8 ± 234,9 нг, 11-дегидрокортикостерона - 99,0 ± 20,9 нг. Отношение этих гормонов составило 11,9 ± 1,4 (см. таблицу). Отсюда видно, что у интактных животных содержание кортикостерона в надпочечниках, так же как и в плазме крови, значительно выше, чем 11-дегидрокортикостерона. Эти данные оригинальны, поскольку в доступной литературе и базах данных информационных систем не удалось найти работ, где бы исследовали содержание кортикостероидных гормонов в надпочечниках крыс методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Ранее надпочечники исследовали методом тонкослойной хроматографии, предел чувствительности которого составляет около 100 нг на 1 определение и потому для определения гормонов в надпочечниках для анализа брали органы от нескольких животных.

У крыс, подвергнутых лапаротомии, мы наблюдали двукратное достоверное увеличение уровня кортикостерона в плазме крови по сравнению с интактными животными. По уровню 11-дегидрокортикостерона достоверных отличий от контроля не отмечено. Отношение кортикостерон/11-дегидрокортикостерон увеличилось достоверно (см. таблицу).

Таким образом, под влиянием острого стрессового воздействия уровень кортикостерона в большей степени, чем в контроле, превышает уровень его обратимого метаболита в плазме крови.

Суммарное содержание кортикостерона в надпочечниках крыс, подвергнутых лапаротомии, практически не отличалось от контрольных значений. Содержание 11-дегидрокортикостерона было достоверно увеличено. В результате отношение кортикостерон/11-дегидрокортикостерон в ткани надпочечников достоверно снизилось (см. таблицу).

Соотношение исследуемых гормонов в плазме крови и ткани надпочечников показывает, что острое стрессовое воздействие приводит к повышению секреции кортикостерона, поскольку при сходном содержании гормона в надпочечниках его уровень в плазме крови становится в 2 раза выше, и к снижению секреции 11-дегидрокортикостерона, поскольку прирост его содержания в надпочечниках непропорционально выше, чем в плазме крови. Об этом же свидетельствуют и их попарные отношения. Также не исключено превращение 11- дегидрокортикостерона в кортикостерон в печени, катализируемое 1-й (печеночной) изоформой 11р- оксистероиддегидрогеназы, активность которой повышается при стрессе (см. введение). Кроме того, сопоставляя значения концентрации 11-дегидрокортикостерона в плазме крови и его содержания в ткани надпочечников, можно предположить, что острое срессовое воздействие вызывает образование "стратегического запаса" кортикостерона в надпочечниках в виде накопления его обратимого метаболита, что достигается активизацией 2-й изоформы 11р-оксистероиддегидрогеназы в надпочечниках.

Таким образом, настоящее исследование показало, что суждение о глюкокортикоидной функции надпочечников будет более полным, если одновременно анализировать содержание и кортикостерона, и его обратимого метаболита 11-дегидрокортикостерона как в плазме крови, так и в ткани надпочечников. По-видимому, 11-дегидрокортикостерон можно рассматривать как функциональный аналог кортизола у тех видов животных, у которых основным глюкокортикоидом является кортикостерон.

Выводы

1. Отношение содержания в плазме крови крыс основного глюкокортикоида и его обратимого метаболита существенно превышает подобный показатель у людей.
2. При остром стрессе (лапаротомия) увеличение секреции кортикостерона сочетается с повышением содержания 11-дегидрокортикостерона в ткани надпочечников, что создает резервный пул основного глюкокортикоида.