Базальная и люлиберинстимулированная секреция гонадотропинов у овариэктомированных самок крыс со стрептозотоцин-индуцированным диабетом

Известно, что нарушение функциональной ак­тивности репродуктивной системы организма у ла­бораторных животных при диабете связано не только с деструктивными изменениями гонад, но и с дисфункцией гипоталамо-гипофизарного комп­лекса [И, 12]. Показано, что у самок крыс с

экспериментальным диабетом снижение базальной секреции гонадотропинов и половых гормонов и отсутствие ее циклических изменений могут быть обусловлены нарушениями центральной гипотала­мической регуляции репродуктивной системы [6, 14]. Не исключена возможность изменений секре­ции гонадотропинов, связанных с нарушением чув­ствительности гонадотрофов гипофиза к действию люлиберина (ЛГ-РГ). Причем из литературы из­вестно, что у особей мужского и.женского пола эти нарушения проявляются в разной степени [3]. До сих пор остается спорным вопрос о том, на­сколько нарушения, возникающие при диабете, зависят от уровня половых стероидов и инсулина в организме [4, 19]. Учитывая тот факт, что инсу­лин может непосредственно участвовать в регуля­ции функции гонадотрофов [2], мы исследовали в условиях in vitro его влияние на чувствитель­ность гипофиза к ЛГ-РГ на модели овари- жтомированных самок крыс со стрептозотоцинин- цуцированным диабетом, которые получали эстра- циол в качестве компенсаторной гормонотера- 1ИИ.

Концентрация Л Г (/) и ФСГ (//) в среде при инкубации аденогипофизов ОВК (в), ОВК+Ег (б) или ОВК-ЬЕг-|- 4-СТЗ (в).

Светлые столбики — бдзальный уровень гормона (/), темные — при нагруз­ке ЛГгРГ (2), заштрихованные вертикальными линиями — при нагрузке ин­сулином (3), заштрихованные косой клеткой — при нагрузке ЛГ-РГ и ин­сулином (5). Звездочка — /><0.05 при сравнении группы 2 и 1 или 4 и 3, треугольник — р<0,05 при сравнении групп 3 и I.

По оси ординат — содержание гормона ЛГ в среде (в нг на 1 мг ткани), по оси абсцисс — время инкубации (в ч).

Материалы и методы

Опыты проводили на беспородных белых половозрелых самках крыс массой тела 160—180 г, которых содержали в условиях контролируемого температурного режима (22— 25 °C) и освещенности (свет с 5 до 19 ч). Животных оварнзктомировали под эфирным наркозом и через 7 дней вводили стрептозотоцин (СТЗ) в дозе 60 мг на 1 кг массы тела в 0,2 мл цитратного буфера (pH 4,5), внутрибрюшинно или тот же объем буфера. В группу экспериментальных животных отбирали крыс, у которых концентрация глюко­зы в крови составляла более 12 ммоль/л (у контрольных животных — 2,7—3,6 ммоль/л). Через 21—25 дней после введения СТЗ животные получали эстрадиола бензоат (Ej) в дозе 5 мкг в 0,2 мл оливкового масла. Крыс дека­питировали через 72 ч, извлекали аденогипофизы, которые делили на 2 части и по 2 половинки от разных гипофизов преинкубировали в 1 мл среды 199, насыщенной в атмосфере 95 % О₂ и 5 % СОг и содержащей 20 ммоль HEPES и 20 ммоль бацитроцина («Serva»). После смены среды гипо­физы инкубировали при 37 °C при постоянном встряхивании с добавлением ЛГ-РГ (50 нг/мл) и/или инсулина (24 мкЕД/мл) в течение 5 ч, собирая аликвоты по 20 мкл каждый час для последующего определения лютеинизирую­щего (ЛГ) и фолликулостимулирующего (ФСГ) гормонов, причем через 4 ч проводили замену среды на новую.

Определение концентрации ЛГ и ФСГ в среде проводили радиоиммунологическим методом с использованием наборов NIDDK (США). Концентрацию гормонов выражали в нано­граммах NIDDK-rLH-RP-З и NIDDK-rFSH-RP-2 соответствен­но на 1 мг ткани гипофиза.

Результаты обрабатывали статистически с помощью /-кри­терия Стьюдента.

Результаты и их обсуждение

Определение секреции гонадотропинов адено­гипофизами овариэктомированных самок крыс (ОВК) в условиях in vitro показало, что добав­ление в среду ЛГ-РГ вызывает увеличение кон­центрации ЛГ только через 3 ч инкубации (см. рисунок, I, а), а ФСГ — через 5 ч (см. рису­нок, II, а). Инсулин не влиял на параметры ба­зальной и ЛГ-РГ-стимулированной секреции Л Г, но ускорял ответную реакцию ФСГ на введение ЛГ-РГ, которую регистрировали через 3 ч. Пред­варительное введение животным Ег не вызывало особых изменений уровня базальной секреции го­надотропинов, но ЛГ-РГ-стимулированная секре­ция гормонов была иной: увеличение концент­рации ЛГ наблюдали уже через 1 ч инкубации (см. рисунок, /, б), а ФСГ — через 3 ч (см. рису­нок, II, б). Максимальное увеличение концентра­ции гормонов в среде регистрировали через 5 ч. Такая же тенденция сохранялась после до­бавления инсулина в инкубационную среду.

Известно, что введение половых гормонов ОВК вызывает массивное высвобождение гонадотро­пинов из гипофиза, аналогично тому, как это наблюдается у интактных самок крыс в стадию проэструса (П). Эта модель позволяет изучать действие половых гормонов по механизму отри­цательной и положительной обратной связи на уровне гипоталамо-гипофизарного комплекса. В утренние часы, через 72 ч после введения Ег чувствительность гипофиза к ЛГ-РГ примерно та­кая, как и в первой половине дня стадии П. Из литературы известно, что секреция гонадо­тропинов у ОВК осуществляется на повышенном уровне, аналогичном тому, который характерен для первой половины дня стадии П [8]. В на­шем эксперименте прослеживалась подобная закономерность. Однако изменение ЛГ-РГ-стиму- лированной секреции гонадотропинов было раз­личным у ОВК и ОВК+Ег: чувствительность гипофизов ОВК+Ег к ЛГ-РГ была выше, чем у ОВК.

Полученные результаты согласуются с пред­ставлением о том, что у ОВК повышенный уро­вень гонадотропинов в циркулирующей крови связан не с повышенной чувствительностью гипо­физа к ЛГ-РГ, а с одновременным увеличением скорости синтеза и секреции гонадотропинов из аденогипофиза |8, 13].

В следующей серии опытов исследовали осо­бенности секреции гонадотропинов из адено­гипофизов ОВК+Ег с экспериментальным диабе­том в условиях in vitro. Для этой группы жи­вотных была характерна повышенная скорость базальной секреции как Л Г (см. рисунок, 1, в), так и ФСГ (см. рисунок, II, в) во все временные интервалы. ЛГ-РГ-стимулированный ответ ЛГ ре­гистрировали через 2 ч инкубации и по амплитуде он был ниже, чем у ОВК+Ег, составляя 160,8 % относительно контроля, тогда как в группе ОВК+Ег — 227 %.

Инкубация гипофизов животных опытной груп­пы с инсулином значительно изменяла парамет­ры как базальной, так и ЛГ-РГ-стимулированной секреции гонадотропинов: уровень базальной секреции гормонов снижался до такового конт­рольной группы животных, а величина ЛГ-РГ- вызванной секреции гонадотропинов даже пре­вышала ту, которую наблюдали у контрольных животных.

Таким образом, полученные результаты сви­детельствуют о том, что чувствительность гипо­физа к ЛГ-РГ у ОВК+Ег снижена при стрепто- зотоцининдуцированном диабете. Причем это сни­жение не связано с измененным уровнем половых гормонов при данном заболевании, так как жи­вотные получали заместительную гормоноте­рапию.

Данные литературы по этому вопросу довольно разноречивы. Так, L. Seethalakshimi и соавт. [15] наблюдали снижение чувствительности гипофиза к ЛГ-РГ у самцов крыс со стрептозотоцинин- дуцированным диабетом. Q. Dong и соавт. [7] сообщили о снижении амплитуды пиков пуль­сирующей секреции ЛГ у орхиэктомированных крыс с экспериментальным диабетом, индуциро­ванным стрептозоцином, в ответ на импульсное введение экзогенного ЛГ-РГ. В работе М. Tesone и соавт. [18] у ОВК крыс, получавших стрептозо- тоцин, зарегистрировано снижение биологически активного, но не иммунореактивного ЛГ в ответ на введение ЛГ-РГ, тогда как С. Valdes и со­авт. [19] наблюдали гиперответ секреции ЛГ на внутривенное введение ЛГ-РГ у самок крыс с экспериментальным диабетом на стадии диэстру- са. В то же время S. Katayama и соавт. [11] не выявили различий чувствительности гипофиза к экзогенному ЛГ-РГ между группами больных диа­бетом и контрольных самок крыс, предполагая на основании этого, что нарушение функциональной активности гипофиза и ановуляция у крыс, боль­ных диабетом, связано в первую очередь со сни­жением продукции ЛГ-РГ. На основании получен­ных результатов мы не исключаем этой возмож­ности, тем более что в предыдущей работе [ 1 ] нами было показано изменение активности ЛГ-РГ- продуцирующей системы гипоталамуса у самцов крыс при диабете. Что касается разноречивости данных, полученных разными авторами, то, по; видимому, они обусловлены известными половыми различиями, а также использованием разных мето­дологических приемов и животных с различной длительностью заболевания.

Другой особенностью, отмеченной у животных, больных диабетом, была повышенная базальная секреция гонадотропинов по сравнению с группой контроля. По-видимому, это также связано с нарушениями гипоталамо-гипофизарной оси, вызванными диабетом. В работе мы не опреде­ляли суммарного содержания гонадотропинов в гипофизе. Однако из литературы известно, что при диабете концентрация ЛГ и ФСГ в гипофизе повышена [10, 17] в результате нарушения секре­торной активности гонадотрофов по механизму обратной связи. К такому выводу авторы пришли на основании того, что у животных при диабете на фоне сниженного уровня половых гормонов отме­чен сниженный уровень ЛГ в крови. В нашем эксперименте подопытные и контрольные живот­ные имели одинаковый уровень половых гор­монов в циркулирующей крови, поэтому наблю­даемые изменения секреторной активности гонадо­трофов могли быть обусловлены другими причи­нами, в частности связанными с развитием гипер­гликемии и гипоинсулемии.

В работе мы изучали возможное влияние ин­сулина на секреторную активность гонадотрофов в условиях in vitro и показали, что добавление инсулина в инкубационную среду способствует снижению базальной секреции ЛГ и ФСГ до уровня, наблюдаемого у контрольных животных, а чувствительность гонадотрофов к ЛГ-РГ возрас­тает у ОВК+Ег, получавших СТЗ. В то же время инсулин практически не влиял на эти параметры у ОВК и ОВК+Ег. То, что инсулин способен ме­нять секреторную активность клеток гипофиза, уже сообщалось в литературе. Например, показа­но его тормозящее влияние на соматотрофы [5] и лактотрофы [16], активирующее действие на гонадотрофы в культуре клеток гипофиза [2], регуляторное влияние на функцию нейрогипофи­за [9]. В отличие от этих сообщений мы не заре­гистрировали значительного влияния инсулина на базальную и ЛГ-РГ-стимулированную секрецию гонадотропинов у животных, не получавших с СТЗ. И это в первую очередь связано с условиями проведения экспериментов: в нашем случае ис­пользовалась кратковременная инкубация гипо­физов, в цитируемых работах — культура клеток и следовательно воздействие инсулина было более длительным и могло влиять на процессы как син­теза, так и секреции гормонов.

Можно предположить, что в норме инсулин оказывает тоническое влияние на секреторную активность клеток аденогипофиза по принципу отрицательной обратной связи. Именно этим, по- видимому, можно объяснить торможение базаль­ной секреции ЛГ и ФСГ у крыс, больных диабетом, после добавления инсулина к среде. Каким обра­зом и на каком уровне осуществляется данное влияние инсулина, остается пока неясным.

В заключение следует отметить, что получен­ные результаты свидетельствуют о нарушении чувствительности гонадотрофов гипофиза к ЛГ-РГ при экспериментальном диабете и возможной фи­зиологической роли инсулина в регуляции репро­дуктивной функции организма на уровне гипо­физа.

Выводы

1. Введение Ег овариэктомированным самкам крыс изменяет характер ЛГ-РГ-стимулированной секреции гонадотропинов из аденогипофиза.
2. Уровень базальной, но не ЛГ-РГ-стимули- рованной секреции гонадотропинов повышен у крыс с экспериментальным диабетом.

Инсулин тормозит базальную и повышает ЛГ-РГ-стимулированную секрецию ЛГ и ФСГ у ОВК, получавших Е2, со стрептозотоцининдуци- рованным диабетом.