Анализ гипоталамо-гипофизарно-гонадальных взаимоотношений у самок крыс при экспериментально вызванном диабете

Логическим продолжением выполненных нами ранее работ [4, 5] по анализу взаимосвязи нару­шений репродуктивной системы и полового пове­дения у самцов крыс при диабете явились иссле­дования по оценке состояния репродуктивной си­стемы у самок крыс при экспериментальном диа­бете, вызванном введением стрептозотоцина (СТЗ). Известно, что в отличие от самцов, для самок характерны циклические изменения актив­ности репродуктивной системы. Следовательно, не исключено, что наблюдаемые в норме различия в регуляции гонадотропной функции гипофиза у самцов и самок крыс могут объяснять тот факт, что самцы, в основном более чувствительны к гипергликемическому действию СТЗ, чем самки [13]. Кроме того, некоторые данные указывают на неодинаковые изменения в организме самцов и самок при дефиците инсулина [10]. На основа­нии результатов морфологических и физиологиче­ских исследований G. Bestetti и соавт. [7] заклю­чили, что у самок крыс изменения в гипофизе менее выражены, чем у самцов. Трактовка резуль­татов, полученных разными исследователями при изучении репродуктивной системы у самок при диабете, осложнена наличием циклических изме­нений.

Нарушения цикличности при тяжелых формах диабета могут быть обусловлены множественны­ми нарушениями гипоталамо-гипофизарно-гонад-

Содержание Л Г, ФСГ, Э₂, Т и инсулина (ИНС) в сыворотке крови у контрольных (К) и получавших СТЗ самок крыс (М±т)

Примечание. В скобках — число животных. Звездочка — достоверность различий между 1-й и 2-й, 1-й и 3-й и 2-й и 4-й группами р<0,05.

ной оси, включающей как структуры ЦНС, так и уровень яичников.

В работе проведено комплексное исследова­ние функциональной активности гипоталамо-гипо- физарно-гонадной системы у самок крыс со стреп- тозотоциновым диабетом. Для этого определяли концентрацию ядерных рецепторов половых гормо­нов в аденогипофизе и областях гипоталамуса, участвующих в регуляции секреции гонадотропи­нов по механизму обратных связей. Кроме того, у овариэктомированных самок крыс с компенса­торным введением эстрадиола (Эг) и прогестерона определяли чувствительность гипофиза к люли- берину (ЛГ-РГ) с целью исключения возможно­го нарушения секреции стероидов на уровне яич­ников при диабете.

Материалы и методы

В опытах использовали беспородных половозрелых са­мок крыс массой тела 170—200 г, которых содержали в усло­виях контролируемого температурного режима (22—25 °C) и освещенности (свет с 5 до 19 ч). В ходе эксперимента все животные имели свободный доступ к пище и воде. Интакт­ным циклирующим и овариэктомированным (через 7 дней после операции) самкам вводили (внутрибрюшинно) СТЗ в дозе 60 мг на 1 кг массы тела в 0,2 мл цитратного буфера, pH 4,5. В группу экспериментальных животных отбирали только тех крыс, у которых концентрация глюкозы в крови составляла не менее 12 ммоль/л (при уровне у контрольных самок — 2,7—3,6 ммоль/л). Через 14 дней после индукции диабета у самок ежедневно брали влагалищные мазки для проверки астральной цикличности. У 65—80 % животных, боль­ных диабетом, отмечали постоянный диэструс (Д). Материал у самок брали в 10 ч стадии Д| и 13 или 17 ч стадии проэструса (П) у контрольных животных или в предполагаемую стадию П у подопытных крыс, в вагинальных мазках кото­рых наряду с эпителиальными клетками наблюдали много лейкоцитов. В сыворотке крови определяли концентрации поло­вых гормонов, гонадотропинов и инсулина.

Овариэктомированным самкам, контрольным и получавшим СТЗ, через 21 день вводили половые стероиды: Э₂ (5 мкг в 0,2 мл масла) и через 72 ч прогестерон (20 мг в 0,2 мл масла).

После декапитации интактных животных на стадиях Д и П гипоталамические фрагменты (преоптико-переднегипоталами- ческая область — ПО и область медиобазального гипотала­муса — МБГ) и аденогипофизы, объединенные от 40 крыс, обрабатывали, как было описано ранее для получения ядер- ной фракции |2|. В качестве меченых гормонов использовали 1, 2, 6, 7-³Н-тестостерон и 2, 4, 6, 7-³Н-эстрадиол с высокой удельной активностью (85—105 Ки/мМ). Условия инкубиро­вания меченых стероидов и расчет числа специфических свя­зывающих мест были такими же, как в ранее опубликован­ной работе [6 ]. Количество связывающих мест в ядрах рас­считывали в фемтомолях на 1 мг ДНК.

Овариэктомированных самок крыс декапитировали в 10 и 17 ч (через 72 и 79 ч после введения Э₂ соответственно) и из ткани гипоталамуса выделяли методом микропункции следующие фрагменты: медиальную часть преоптической об­ласти (МПО), аркуатное ядро (АРК) и срединное возвы­шение (СВ). Фрагменты объединяли от 5 животных, гомоге­низировали в 250 мкл 1 н. уксусной кислоты и замора­живали до определения ЛГ-РГ радиоиммунологическим ме­тодом [1]. В качестве стандарта для построения калибровоч­ной кривой и для получения меченого антигена использова­ли синтетический ЛГ-РГ («Hoechst», ФРГ). Концентрацию ЛГ-РГ выражали в нанограммах на 1 мкг белка, который определяли методом М. Bradford [9].

В сыворотке крови всех групп животных измеряли содер­жание ЛГ и ФСГ радиоиммунологическим методом с ис­пользованием наборов NIDDK (США). Концентрацию гормо­нов выражали в нанограммах NIDDK-rLH-RP-З и NIDDK-rFSH-RP-2 соответственно на 1 мл сыворотки крови. Содержание.Э₂ и тестостерона (Т) в крови определяли набо­рами для радиоиммунологического анализа ESTR-Direct («So­rin», Франция) и TESTO-CT (Франция). Концентрацию гор­монов выражали в пино- и нанограммах на 1 мл сыворотки соответственно. Уровень инсулина в крови определяли с по­мощью набора рио-ИНС-ПГ-^|251 и выражали в микроеди­ницах на 1 мл сыворотки. В цельной урови измеряли концентра­цию глюкозы глюкозооксидазным методом на приборе «Эк- сан», которую выражали в миллимолях на I л.

Результаты обработаны статистически с помощью t-крите- рия Стьюдента.

Результаты и их обсуждение

В первой серии опытов определяли содержание гонадотропинов и половых стероидов в крови у интактных и получавших СТЗ самок крыс. У экспе­риментальных групп животных содержание ЛГ и ФСГ в стадии Д| и предполагаемого П было снижено по сравнению с их уровнем в соответ­ствующие стадии у интактных циклирующих крыс (см. таблицу). Кроме того отмечалось резкое сни­жение концентрации Эг в обеих стадиях цикла у самок, получавших СТЗ. В отличие от интактных крыс, у которых уровень Т в крови был выше в стадии П (17 ч), чем в дневные часы стадии Д|, у экспериментальных самок уровень андрогена в крови был одинаковым в обеих стадиях. Таким об­разом, при развитии сахарного диабета у самок крыс циклические изменения уровня гонадотропи­нов и половых гормонов в крови практически отсутствуют.

В следующей серии опытов исследовали зави­симость этих изменений от действия половых гор­монов на гипоталамо-гипофизарный комплекс по механизму обратных связей. Одним из показате­лей этого действия стероидов является уровень их рецепторов в гормончувствительных тканях. Как видно на рис. 1,а, в норме отмечали увели­чение концентрации ядерных рецепторов Эг в ПО в 17 ч стадии П по сравнению с их уровнем в этой области в 10 ч стадии Дь У крыс, полу­чавших СТЗ, не наблюдали такого повышения

о                                                 6

Рис. 1. Концентрация ядерных рецепторов Э2 в ПО (светлые столбики), МБГ (заштрихованные столбики) (а) и гипофи­зе (б) контрольных самок крыс (/) и получавших СТЗ (2).

По оси ординат — связанный ³Н-эстрадиол в ядерной фракции (в фмоль на 1 мг ДНК); по оси абсцисс — стадия цикла, а — звездочка: р<0,01 при сравнении с концентрацией рецепторов в .ПО в стадии Д у контрольной группы и в ПО в стадии П у опытной группы; б — звездочка: р<0,001 при сравнении с кон­центрацией рецепторов в стадии Д у контрольной группы и в стадии П у опыт­ной группы.

уровня ядерных эстрогенных рецепторов в ПО в стадии предполагаемого П. В стадии Д1 число ядерных Э2 связывающих мест в ПО и МВТ не различалось у контрольных и эксперименталь­ных самок. Следует также отметить, что в ста­дии Д| как у контрольных самок, так и у крыс, получавших СТЗ, концентрация ядерных рецепто­ров эстрогенов была выше в МБГ, чем в ПО.

Наблюдающееся в норме увеличение (в 3 раза) числа Эг связывающих мест в ядерной фракции гипофиза в 17 ч стадии П отсутствовало в стадии предполагаемого П у крыс, получавших СТЗ (рис. 1,6).

В отношении уровня рецепторов андрогенов можно заметить, что у интактных самок концент­рация ядерных рецепторов Т в гипофизе была вы­ше в стадии П, чем в стадии Дь У крыс с диабе­том уровень ядерных рецепторов андрогенов в ги­пофизе был одинаковым в стадиях Д| и предпо­лагаемого П (рис. 2, б). При этом не обнаружено различий в числе ядерных тестестерон-связываю- щих мест в ПО и МБГ по стадиям у СТЗ- получавших и контрольных самок крыс (рис. 2, а).

Таким образом, очевидно, что развитие диабета у самок сопровождается отсутствием преовуляр- ной волны гонадотропинов. На основании полу­ченных нами данных можно предположить, что в основе этого процесса лежит снижение уровня Эг в крови и концентрации ядерных рецепторов Эг

8

Рис. 2. Концентрация ядерных рецепторов Т в ПО (светлые столбики), МБГ (заштрихованные столбики) (а) и гипофи­зе (б) контрольных самок крыс (/) и получавших СТЗ (2).

По оси ординат — связанный ³Н-тестостерон в ядерной фракции (в фмоль на 1 мг ДНК); по оси абсцисс — стадия цикла, б — звездочка: р<0,05 при сравнении с концентрацией рецепторов в стадии Д.

Рис. 3. Концентрация ЛГ (светлые столбики) и ФСГ (темные столбики) в сыворотке крови (а), а также содержание ЛГ-РГ в ПО (светлые столбики), АРК (вертикально заштрихованные столбики) и СВ (столбики с косой штриховкой) (б) у овари­эктомированных самок крыс, получавших половые гормоны (/) и СТЗ (2).

По оси ординат: а — концентрация Л Г (в нг/мл); б — концентрация ЛГ-РГ (в пг на 1 мкг белка); по оси абсцисс — время дня (в ч).

а.     I — две звездочки: р<0,001 при сравнении с концентрациями ЛГ и ФСГ в 10 ч; а, 2 — одна звездочка: р<0,01 при сравнении с концентрациями ЛГ и ФСГ в 10 ч; а, 2 — треугольник — р<0,01 при сравнении с концентрациями ЛГ и ФСГ в контрольной группе (/) в те же временные интервалы.

б,     1 — одна звездочка — р<0,01 при сравнении с концентрацией ЛГ-РГ в соответствующей области в 10 ч; б, 2 — треугольник — р<0,01 при сравне­нии с концентрацией ЛГ-РГ в соответствующей области у контрольных групп (/) в 10 ч.

в ПО и гипофизе, т. е. в тех областях ЦНС, которые участвуют в регуляции освобождения го­надотропинов по механизму положительной обрат­ной связи в ключевую стадию эстрального цикла. Следует, однако, заметить, что механизм отрица­тельной обратной связи, опосредуемый через эстрогенные рецепторы МБГ, не нарушается у са­мок крыс с экспериментальным диабетом.

Ранее [3] мы показали, что андрогенные ре­цепторы гипофиза также играют важную роль в циклической секреции гонадотропных гормонов. И в данной работе уровень Т в крови и ядерных рецепторов Т в гипофизе был выше в 17 ч стадии П, чем в стадии Д|, у интактных циклирующих са­мок. Концентрация же ядерных рецепторов Т не претерпевала изменений в ПО и МБГ ни в одну из стадий эстрального цикла. При дефиците инсу­лина в организме отсутствовали циклические из­менения в уровне Т в сыворотке, при этом не наб­людали и повышения концентрации андрогенных рецепторов в предполагаемую стадию П. На осно­вании полученных данных можно заключить, что отсутствие овуляции у самок крыс при диабете, отмечаемое многими исследователями, по край­ней мере частично, обусловлено снижением кон­центрации эстрогенных и андрогенных рецепторов в гипофизе и эстрогенных рецепторов в ПО в ста­дии П.

Однако полученные нами данные не позволяют ответить на вопрос, что является основной при­чиной этих нарушений: деструкция гонад, приводя­щая к снижению продукции половых гормонов, или дефицит инсулина в организме вызывает на­рушение гипоталамо-гипофизарного комплекса. Для исследования этого вопроса была выполнена серия опытов на овариэктомированных самках, которым вводили половые гормоны по определен­ной схеме, вызывающей волну гонадотропинов, подобную той, которая наблюдается в стадии П.

Введение Эг снижало уровень ЛГ и ФСГ в кро­ви, причем у животных, получавших СТЗ, даже в большей степени, чем у контрольных крыс. На фоне введения прогестерона отмечали развитие гонадотропинвызванной волны в 17 ч. Однако у экспериментальной группы ее амплитуда была го­раздо ниже (примерно в 5 раз), чем у контрольной.

Таким образом, нарушение цикличности при диабете, хотя и связано с дефицитом половых гормонов в циркулирующей крови, однако компен­сация их уровня в организме не восстанавливала функциональную активность репродуктивной си­стемы в полном объеме. По-видимому, это обуслов­лено нарушением и других регуляторных механиз­мов гипоталамо-гипофизарно-гонадальной оси.

В следующей серии опытов мы исследовали из­менения концентрации ЛГ-РГ в областях гипота­ламуса, связанных с продукцией этого либерина и регуляцией секреции гонадотропинов. На рис. 3 видно, что в утренние часы, когда секреция гона­дотропинов находится на базальном уровне, содер­жание ЛГ-РГ было более низким во всех об­ластях у животных экспериментальной группы, чем у контрольной. В период вызванной волны гонадотропинов уровень ЛГ-РГ в группе контроля снижался в СВ, ПО и АРК. В отличие от этого в экспериментальной группе содержание ЛГ-РГ бы­ло на том же уровне, что и в утренние часы. Сопоставляя полученные результаты с изменения­ми содержания гонадотропинов в крови, можно предполагать, что повышенная секреция гонадо­тропинов, вызванная введением половых гормо­нов, сопровождается интенсивным высвобожде­нием ЛГ-РГ в сосуды портальной системы, след­ствием чего является истощение ЛГ-РГ-продуци- рующей системы гипоталамуса. Однако в группе экспериментальных животных уровень ЛГ-РГ в утренние часы был значительно снижен в ПО и АРК, т. е. в местах локализации клеточных тел и проводящих путей, но оставался на уровне контроля в СВ — месте высвобождения ЛГ-РГ в сосуды портальной системы. К 17 ч содержание ЛГ-РГ во всех областях не отличалось от тако­вого в утренние часы.

Анализируя эти данные и учитывая уровень гонадотропинов в крови, можно предположить, что при диабете, по-видимому, в первую очередь нарушена продукция ЛГ-РГ, поскольку наблюда­ли снижение концентрации либерина в тех об­ластях, которые связаны с его синтезом и транс­портом. Однако снижение содержания ЛГ-РГ в СВ может быть обусловлено истощением, связанным с повышенным высвобождением ЛГ-РГ из СВ, а сниженный уровень гонадотропинов обусловлен снижением чувствительности гипофиза к ЛГ-РГ у крыс с экспериментальным диабетом.

Аналогичные результаты о снижении уровня ЛГ-РГ в СВ при экспериментальном диабете у самок крыс были получены G. Bestetti и соавт. [7]. Данные же С. Valdes и соавт. [15] о снижен­ной чувствительности гипофиза к экзогенному ЛГ- РГ позволяют предполагать истощение ЛГ- РГ-продуцирующей системы, связанное с повы­шенным высвобождением в сосуды портальной системы.

Отсутствие изменений уровня ЛГ-РГ к 17 ч, в период максимального содержания гонадотропи­нов в крови после введения стероидов, также свидетельствует о том, что отсутствие цикличе­ской секреции гонадотропинов при диабете связа­но с нарушением активности гипоталамических центров регуляции репродуктивной функции. Под­тверждением этого являются данные морфологи­ческих исследований, свидетельствующие о де­структивных изменениях в ЛГ-РГ-продуцирующих аксонах МБГ при дефиците инсулина в организ­ме [8]. Нельзя исключить также опосредованно­го влияния измененного уровня инсулина при диа­бете на функцию ЛГ-РГ-продуцирующей систе­мы через изменения активности нейромедиаторных систем мозга. Например, установлено, что у линии мышей с генетически обусловленным диабетом снижен синтез катехоламинов в ПО в возрасте 2—5 мес, а в более позднем возрасте — также в области МБГ и СВ [12]. В этих же областях гипоталамуса у крыс, получавших СТЗ, было от­мечено изменение активности нейропептида Y [14] и серотонина [11].

Таким образом, на основании полученных ре­зультатов можно предположить, что изменение базальной и циклической секреции гонадотропи­нов у крыс с экспериментально вызванным диа­бетом связано с нарушением активности ЛГ-РГ-продуцирующей системы и рецепторного связывания на уровне гипоталамо-гипофизарного комплекса.

Выводы

• Введение СТЗ самкам крыс приводило к нарушению эстрального цикла и сопровождалось уменьшением базальной и циклической секреции гонадотропинов и половых гормонов.
• При развитии сахарного диабета у цикли­рующих самок крыс концентрация ядерных рецеп­торов Эг снижалась в ПО и гипофизе. При этом число ядерных Т-связывающих мест снижалось только в гипофизе.

Волна гонадотропинов, стимулированная по­ловыми стероидами у овариэктомированных самок крыс, больных диабетом, была значительно сни­жена, что обусловлено изменением активности ЛГ-РГ-продуцирующей системы.