Активаторы плазминогена урокиназного и тканевого типов и их ингибитор при заболеваниях щитовидной железы

В последнее десятилетие повсеместно отмечает­ся увеличение частоты заболеваемости раком щи­товидной железы (РЩЖ) [6], причиной которого считают ухудшение экологической обстановки, ра­диоактивное загрязнение. Согласно современным данным литературы, частота случайного выявления онкологических заболеваний щитовидной железы (ЩЖ) при лечении эутиреоидного узлового зоба составляет 0,4—6%, а частота опухолей при токси­ческом зобе 0,5—21,5% [1]. Диагностика гиперпла­стических и опухолевых процессов в ЩЖ затруд­нена. В начальных стадиях болезни ошибки диаг­ностики составляют 50—100%, а при поступлении больных в клинику ошибки диагностики наблюда­ются в 33,2—85% случаев [5]. В связи с этим боль­шое внимание уделяется разработке новых методов обследования для своевременной диагностики и лечения РЩЖ, в частности разработке новых тест- систем для оценки риска малигнизации гиперпла­стических изменений и метастазирования рака.

В последние годы четко установлено, что одним из основных механизмов инвазии и метастазирова­ния злокачественных опухолей является разруше­ние окружающей базальной мембраны и внекле­точного матрикса ассоциированными с опухолью протеазами [14]. Центральную роль в этих процес­сах играет активатор плазминогена урокиназного типа (иРА), являющийся ключевым звеном проте­олитического каскада, приводящего к образованию плазмина, разрушающего компоненты опухолевой стромы [2, 8, 9]. Известно, что система активации плазминогена имеет также непосредственное отно­шение к процессам неоангиогенеза в опухолях [11]. Активность иРА регулируется несколькими спосо­бами, в частности подавляется двумя белковыми ингибиторами, принадлежащими к семейству сер- пинов, — PAI-1 и PAI-2 [7]. Помимо иРА в акти­вации плазминогена в опухолях участвует также ак­тиватор плазминогена тканевого типа (tPA) [8]. В норме оба эти фермента являются компонентами фибринолитической системы, при этом tPA секре­тируется преимущественно эндотелиальными клет­ками, а иРА — клетками паренхимы [8]. Роль tPA при развитии опухолей, по-видимому, противопо­ложна роли иРА и сводится к разрушению опухо­левых клеток и защите окружающих тканей от рас­пространения опухоли. Оба ингибитора иРА эф­фективно действуют и на tPA.

Содержание иРА и PAI-1, как правило, сущест­венно выше в злокачественных опухолях, чем в доброкачественных и в нормальных тканях [4, 9]. Для tPA часто отмечается противоположное соот­ношение. Показано также, что при некоторых зло­качественных новообразованиях, в частности при раке молочной железы, высокие уровни иРА и PAI- 1 и низкий уровень tPA являются факторами не­благоприятного прогноза заболевания [2, 9]. Роль системы активации плазминогена при злокачест­венных и доброкачественных заболеваниях ЩЖ на клиническом материале практически не изучена.

Цель настоящего исследования — сравнитель­ное изучение содержания некоторых основных компонентов системы активации плазминогена — uPA, tPA и PAI-1 в цитозольной фракции рака и тканей доброкачественных образований ЩЖ, а также соотношения этих показателей с клинико­морфологическими особенностями РЩЖ.

Материалы и методы

Обследовано 146 пациентов (129 женщин и 17 мужчин в возрасте от 40 до 52 лет) с заболеваниями ЩЖ, находившихся на лечении в Российском он­кологическом научном центре им. Н. Н. Блохина РАМН и Московском областном научно-исследо­вательском клиническом институте им. М. Ф. Вла­димирского с января 1997 г. по ноябрь 1999 г. У всех больных диагноз был установлен впервые и подтвержден данными гистологического исследо­вания операционного материала, на основании ко­торого были выделены следующие группы пациен­тов: 1-я — 19 больных (средний возраст 49,7 ± 3,2 года) узловым коллоидным зобом (УЗК) с очагами микрофолликулярной пролиферации (с аденома­тозом); 2-я — 43 больных (46,3 ± 2,5 года) УЗК без очагов микрофолликулярного строения (без адено­матоза); 3-я — 9 больных (46,9 ± 4,4 года) диффуз­ным токсическим зобом (ДТЗ) в сочетании с оча­говым аденоматозом, 4-я — 13 больных (40,7 ± 3,2 года) ДТЗ без очагов аденоматоза; 5-я — 18 боль­ных (52,0 ± 3,4 года) аденомой щитовидной желе­зы (АЩЖ); 6-я — 44 больных (53,0 ± 3,0 года) (РЩЖ) на различных стадиях опухолевого процес­са (27 папиллярных, 13 фолликулярных и 4 медул­лярных рака).

К аденоматозным пролифератам относили не­большие (до 2—3 мм) очаги пролиферации тирео­идного эпителия микрофолликулярно-солидного строения. Отсутствие капсулы не позволяло отне­сти эти образования к аденомам.

Концентрацию uPA, PAI-1 и tPA определяли в цитозолях, полученных по стандартной методике, используемой при определении рецепторов стеро­идных гормонов и разведенных в 10 раз К, Na-фос- фатным буфером (14 мМ NaCl, 2,7 мМ КС1, 1,5 мМ КН₂РО₄, 8,1 мМ Na₂HPO₄, pH 7,4), содержащим 0,1% Твин-20 и 1% БСА. Определение проводили с помощью стандартных наборов реактивов для им- муноферментного анализа, разработанных в Като­лическом Университете Ниймегена (Нидерланды), как описано ранее [3, 10]. Измерения осуществля­ли на автоматическом ридере для микроплашек ELX800 фирмы "Bio-Tek Instruments, Inc." (США) при 492/630 нм. Обработку результатов измерений проводили по формуле

Y = а + ЬХ + сХ²,

где X — концентрация анализируемого белка (в нг/мл), a Y — оптическая плотность при 492 нм. Концен­трации анализируемых показателей выражали в на­нограммах на 1 мг белка цитозоля. Содержание белка определяли по методу Лоури.

Для статистической обработки использовали критерий Стьюдента, при множественных сравне­ниях — непараметрические критерии: медианный тест и тест Краскел—Уоллиса. Статистическую об­работку данных осуществляли с помощью про­граммного пакета Statistica ("StatSoft Inc., 1996, вер­сия 5.5).

Результаты и их обсуждение

В большинстве исследованных тканей (86—100%) обнаружены измеримые количества всех трех компо­нентов системы активации плазминогена. Пределы колебаний, средние уровни и медианы концентраций исследованных показателей в тканях больных с раз­личной патологией ЩЖ представлены в табл. 1 (все больные РЩЖ объединены в одну группу).

Таблица 1

Концентрации uPA, tPA и PAI-1 (в нг/мг белка) в зависимости от патологии ЩЖ

При ме ча ние. ПК — пределы колебаний; * — р,_₂ и д_₄ < 0,01; р,__}, р_х_₅ и р_1-6 < 0,05; ** — p_t_₂ ир,_₆ < 0,01;                                              < 0,02 и

А-s < 0,05; *•* - р,_₅ < 0,05.

Таблица 2

Концентрации uPA, tPA и PAI-1 (в нг/мг белка) в цитозолях больных РЩЖ в зависимости от стадии заболевания, размера первичной опухоли и наличия регионарных метастазов

Примечание. В числителе — М + т, в знаменателе — пределы колебаний; * — для иРА: р,__ш < 0,05; p_t__n < 0,01; р_ц_ _ш < 0,05; Pn__IV < 0,01; для tPA:                                                             < 0,05; p_t__n < 0,01; для PAI-

1 Ai-ш < 0,05; ** - для иРА р,_„ < 0,05; для tPA _Рб_, < 0,02; *** — для иРА p_N0__N1_₂ < 0,05.

Самый высокий средний уровень иРА обнару­жен при РЩЖ (0,78 ± 0,15 нг/мг белка, медиана 0,34 нг/мг белка, все различия достоверны). При всех доброкачественных заболеваниях ГЦЖ медиа­ны концентрации иРА практически не отличались. Тем не менее средние уровни иРА были несколько выше при УКЗ, чем при ДТЗ (см. табл. 1). Таким образом, наблюдается выраженное (в 2—3 раза) по­вышение уровня иРА при РЩЖ по сравнению с показателями при всех изученных доброкачествен­ных заболеваниях этого органа.

Наиболее низкие показатели концентрации (средний уровень и медиана) tPA были отмечены в цитозолях РЖЩ (1,52 ± 0,23 и 0,99 нг/мг белка со­ответственно; различия со всеми заболеваниями, кроме АЩЖ, достоверны; см. табл. 1). Относитель­но низкий уровень tPA по сравнению с таковым при других доброкачественных заболеваниях отме­чен и при аденоме ЩЖ (2,08 ± 0,27 и 1,79 нг/мг белка). Наиболее высокие показатели концентра­ции tPA в цитозоле выявлены при УКЗ в сочетании с аденоматозом (3,36 ± 0,80 и 3,0 нг/мг белка) и при ДТЗ без аденоматоза (3,08 ± 0,68 и 2,52 нг/мг белка), однако достоверных различий между груп­пами с разными доброкачественными патологиями ЩЖ не выявлено. Диапазон концентраций tPA, выявляемых у отдельных больных, был достаточно широк во всех группах, однако следует отметить, что в группах больных раком, аденомой и ДТЗ с аденоматозом максимальные показатели концен­трации tPA были существенно ниже, чем при дру­гих заболеваниях (см. табл. 1). Таким образом, можно отметить тенденцию к снижению тканевого уровня tPA при опухолевых и предопухолевых (за исключением ДКЗ с аденоматозом) заболеваниях ЩЖ.

Так же, как и для иРА, максимальные показате­ли концентрации PAI-1 в цитозолях обнаружены при РЩЖ (1,15 ± 0,21 и 0,74 нг/мг белка). Близ­кими к этим значениям были показатели PAI-1 у больных УКЗ с аденоматозом и без него (0,64 ±0,17 и 0,42 нг/мг; 0,74 ± 0,98 и 0,30 нг/мг белка) и АЩЖ (0,60 ± 0,12 и 0,49 нг/мг белка).

Таким образом, представленные данные свиде­тельствуют о том, что в опухолях больных РЩЖ выявлены самые низкие уровни tPA и наиболее вы­сокие показатели иРА и PAI-1, тогда как для доб­рокачественных гиперплазий ЩЖ и для АЩЖ бы­ли характерны высокие показатели tPA и относи­тельно низкие уровни иРА в ткани пораженного органа. Наиболее низкие уровни PAI-1 выявлены в цитозольной фракции тканей ЩЖ у больных ДТЗ как с аденоматозом, так и без него. Интересно, что уровень иРА при АЩЖ существенно ниже, чем при УКЗ, и примерно соответствует таковому при ДТЗ.

Поскольку при некоторых злокачественных но­вообразованиях внутриопухолевые концентрации компонентов системы активации плазминогена яв­ляются значимыми факторами прогноза безреци- дивной и общей заболеваемости, мы сочли необхо­димым проанализировать взаимосвязь полученных нами данных с клинико-морфологическими осо-

Таблица 3

Концентрации uPA, tPA и PAI-1 (в нг/мг белка) в цитозолях РЩЖ в зависимости от гистологической структуры, степени дифференцировки опухоли и характера расположения узлов в ЩЖ

Клинико-морфоло­гический параметр

Гистологическая

структура: фолликулярный (а)

папиллярный (б) медуллярный (в)

Степень дифферен­цировки: высокод ифферен - цированный умеренно-диффе­ренцированный низкодифференци­рованный рак Характер располо­жения узлов опу­холи: солитарный

многофокусный

п           иРА

tPA               PAI-1

0,58 ±0,19 1,37 ± 0,37 0,92 ± 0,19* 13              6,03—2,18              0,24-4,77 0,26-2,74

0,87 ± 0,22     1,74 ± 0,32 0,90 ± 0,20*

27 0'002-4'31 6,06-568                   6.05—4^99

0,87 ± 0,52 0,55 + 0,18 3,61 ± 1,44* 4 6,12-2,38 0.T4-W’ Л73-7:б1

0,82 ± 0,20 1,73 ± 0,28 0,96 ± 0,19 29 6,03—4,31               6,19—5,32               0,16-4,99

0,73 ± 0,22 1,18 + 0,42 1,51 + 0,53 14 0^002-2,38              6,06-5,98 0,05-7,61

1           0,45                0,27               1,83

0,72 ± 0,20 1,48 ± 0,33 1,04 + 0,17

22     0,03-3,75        6,19-5,32 ’0,05-3,10'

0,84 ± 0,23     1,56 ± 0,33 1,26 ± 0,39

22 0'002—4^31 6,06-568 6,05-7,6’1..................

Примечание. В числителе — М ± т, в знаменателе — пределы колебаний; * — для PAI-1: р_а__в < 0,001; р₆__в <0,01. бенностями РЩЖ. Результаты этого анализа пред­ставлены в табл. 2 и 3.

Обнаружено достоверное увеличение уровня иРА в цитозолях РЩЖ с увеличением стадии забо­левания (см. табл. 2). Интересно, что уровень tPA также был самым высоким при IV стадии РЩЖ, что может свидетельствовать об усилении некроти­ческих процессов в опухоли на этой стадии забо­левания. Уровень PAI-1 в меньшей степени, чем другие показатели, зависел от стадии РЩЖ: он практически не отличался при I и II стадиях, был максимальным при III стадии и несколько снижал­ся при IV стадии.

Средние уровни иРА и PAI-1 также достоверно возрастали с увеличением размера первичной опу­холи, а также были выше у больных с метастазами в регионарные лимфатические узлы, чем у больных без метастазов (см. табл. 2). Уровень tPA был мак­симальным при больших опухолях (более 5,0 см), но ниже у больных с метастазами, чем у больных без метастазов. Таким образом, концентрации иРА и PAI-1 в опухолях увеличиваются по мере распро­странения РЩЖ, и высокий уровень этих компо­нентов системы активации плазминогена (в осо­бенности иРА), по-видимому, может быть связан с плохим прогнозом при РЩЖ. Уровень tPA неод­нозначно связан с распространенностью РЩЖ, что может быть результатом двух противополож­ных тенденций: снижения уровня tPA по мере рас­пространения опухоли и его увеличения при акти­вации некротических процессов в больших опухо­лях.

Характер течения и прогноз заболевания у боль­ных РЩЖ во многом определяется гистологиче­ским строением опухоли. Тем не менее концентра­ции иРА в цитозолях РЩЖ различного гистологи­ческого строения достоверно не различались, хотя его уровень в фолликулярном раке был в 1,5 раза ниже, чем в папиллярном и медуллярном (см. табл. 3). В то же время в медуллярном РЩЖ, от­личающемся наиболее агрессивным течением, от­мечено достоверное увеличение уровня PAI-1 и достоверное снижение уровня tPA по сравнению с двумя другими гистологическими типами РЩЖ (см. табл. 3).

Важным показателем прогноза любого онколо­гического заболевания является степень диффе­ренцировки опухоли. Среди исследованных нами образцов РЩЖ был только один низкодифферен­цированный рак, в котором обнаружены довольно низкие концентрации всех исследованных белков. Их концентрации в высоко- и умеренно-диффе­ренцированных РЩЖ достоверно не различались (см. табл. 3). Не выявлено также достоверных раз­личий средних концентраций компонентов систе­мы активации плазминогена в ткани РЩЖ в зави­симости от характера расположения опухолевых узлов (солитарная или многофокусная).

Таким образом, по нашим данным, тканевой уровень компонентов системы активации плазми­ногена при РЩЖ почти не зависит от гистологи­ческих особенностей опухоли, но при этом досто­верно коррелирует с распространенностью про­цесса.

В последнее время различным компонентам системы активации плазминогена (в первую оче­редь uPA, PAI-1 и рецепторам иРА) уделяется все больше внимания не только как факторам прогно­за при злокачественных опухолях, но и как биоло­гически активным соединениям, которые играют важную роль в патогенетических механизмах бла- стомогенеза, а именно — в формировании метаста­тического и инвазивного потенциала опухолей. В литературе представлены единичные работы о зна­чимости исследуемых компонентов системы акти­вации плазминогена при заболеваниях ЩЖ. Так, полученные нами иммуноферментным методом данные о том, что компоненты системы активации плазминогена присутствуют в большинстве тканей рака и доброкачественных гиперплазий ЩЖ, со­гласуются с данными иммуногистохимических ис­следований [13, 15, 17]. I. Ito и соавт. [13], однако, не обнаружили связи между клиническими харак­теристиками РЩЖ и уровнем экспрессии иРА и PAI-1. В то же время К. Packman и соавт. [12] на ос­новании экспериментального изучения различных клонов культивируемых клеток фолликулярного рака ЩЖ пришли к выводу о том, что иРА заслу­живает внимания в качестве потенциального фак­тора прогноза при этом заболевании. J. Smit и со­авт. [16], также изучавшие культивируемые клетки фолликулярного РЩЖ, пришли к аналогичному заключению в отношении PAI-1.

Данные, представленные в настоящем исследо­вании, позволяют думать о возможной связи ос­новных компонентов системы активации плазми­ногена, а именно uPA, tPA и PAI-1, с процессами бластомогенеза в ЩЖ и распространения и про­грессии РЩЖ. Они свидетельствуют о возможно­сти использования изученных показателей для оценки риска малигнизации при гиперплазии и доброкачественных опухолях ЩЖ и, возможно, для прогноза течения заболевания при некоторых формах рака ЩЖ.