Сравнительное изучение действия тироксина и цитоплазматического тироксинсвязывающего белка на синтез митохондриальных белков печени и головного мозга крыс разного возраста

В результате многочисленных исследований |20-22| сложилось представление о том, что основной мишенью действия тиреоидных гормонов является генетический аппарат клетки. Однако, по имеющимся данным, ядро клетки является не единственной точкой приложения гормонов щитовидной железы, так как хорошо известно действие тироксина (Т₄) и трийодтиронина (Т₃) на дыхание митохондрий, окислительное фосфорилирование и свойства мембран митохондрий [19, 23]. Кроме того, в последние годы в цитоплазме различных органов обнаружено большое количество тирсоидгормонсвязывающих белков, роль которых в реализации ядерного и митохондриального действия тиреоидных гормонов в литературе оценивается неоднозначно [1, 10, 11]. Имеющиеся в литературе сведения касаются главным образом роли цитоплазматических белков в связывании и транспорте гормонов щитовидной железы. В то же время действие этих белков на внутриклеточные биохимические и физиологические процессы мало изучено.

Изучение влияния Т₄- и Т₃-связывающих белков на процессы, происходящие в ядре и митохондриях, представляется важным для более полного понимания механизмов действия тиреоид-* ных гормонов. Важным является также изучение тканеспецифического влияния Т₄ и белков, связывающихся с ним, на эти процессы в различные периоды развития, так как известно, что специфичность гормонального эффекта определяет не гормон, а сама ткань-мишень.

Целью работы явилось сравнительное изучение влияния физиологических концентраций Т₄ и обнаруженного ранее нами [4, 5] цитоплазматического Т₄-связывающего белка (модулятор действия Т₄ — МДТ₄) на синтез митохондриальных белков печени и головного мозга крыс разного возраста.

Материалы и методы

Использовали 20-дневные эмбрионы, 7, 20, 45 и 90-днев- ных крысят линии Вистар. Митохондрии и цитоплазматический МДТ₄ выделяли из печени и головного мозга интактных и гипертиреоидных эмбрионов и крысят разного возраста по ранее описанному методу [6, 12]. Очистку МДТ₄ осуществляли с помощью последовательной хроматографии на Т₄-сефа- розе CL-4B, сефакриле S-200 и сефадексе G-50 [6]. Электрофорез препаратов модулятора и стандартных белков (бычий сывороточный альбумин, химотрипсиноген, цитохром С) в присутствии додецилсульфата натрия проводили в 10-15% полиакриламидном геле [13]. Гипертиреоидное состояние у эмбрионов и 7-дневных крысят вызывали введением L-ти- роксина (фирма “Reanal”) в дозе 0,5 мкг на 1 г массы крысам на 13-й день беременности в течение 7 дней. Гипертиреоз у 20, 45 и 90-дневных крысят вызывали введением гормона в течение недели в дозе 1 мкг па 1 г массы за 7 дней до забоя.

О синтезе белков в митохондриях печени и головного мозга судили по включению Ь-|¹⁴С]-лейцина в белки митохондрий. Изолированные митохондрии 1-2 мг/мл инкубировали с 250 мкл белоксинтезирующей смеси, содержащей 40 мМ трис-НС1 (pH 6.9), 30 мМ КС1, 20 мМ калий-фосфатного буфера, 20 мМ MgClj, 10 мМ фосфоэнолпирувата, 60 мкг/мл пируваткиназы, 10 мМ а-кстоглутарата, 120 мМ маннитола, 2 мг/мл БСА, 4 мМ АТФ, 0,2 мМ смеси немеченых аминокислот, 0,01 мкКи/мл Ь-[^|4С]-лейцина и 100 мкг (100 мкл) МДТ₄. Время инкубации 50 мин при 36°С. После инкубации во все пробы добавляли по 500 мкл 10% охлажденной трихлоруксусной кислоты (ТХУ), затем осадки переносили на мил- липоровые фильтры (фирмы “Synpor”), после промывания фильтров 5% ТХУ и 85% этанолом подсчитывали радиоактивность проб на сцинтилляционном счетчике “Rack Beta- 1217" LKB (Швеция). В качестве контроля на отсутствие загрязнения митохондрий белоксинтезирующей системой цитоплазмы использовали циклогексимид (0,5 мМ) и пуроми- цин (50 мкМ). Белок в пробах определяли по методу Лоури [16].

Результаты и их обсуждение

В табл. 1 представлены результаты влияния физиологической концентрации Т₄ и МДТ₄ на синтез митохондриальных белков печени крыс разного возраста. Чистота митохондриальной белоксинтезирующей системы проверялась добавлением в систему циклогсксимида и пуромицина — ингибиторов цитоплазматического и митохондриального синтеза белков. Циклогексимид не оказывает существенного влияния на включение метки в белки митохондрий, тогда как пуромицин примерно на 60-70% подавляет этот процесс в митохондриях печени крыс всех изученных возрастов. Т₄ в дозе 10'⁸ М почти не влияет на синтез митохондриальных белков. Это согласуется с имеющимися данными [2] о том, что в опытах in vitro Т₄ в концентрациях 10'⁹-10'⁵ М не оказывает видимого действия на биохимические процессы в митохондриях.

Из данных литературы известно, что для реализации физиологического действия гормонов [8] на митохондрии необходимо участие цитоплазматических белковых факторов. Одним из таких факторов является белок, обнаруженный японскими авторами [12] и нами |4] в цитоплазме печени и головного мозга крыс, условно названный модулятором действия тироксина (на основании способности белка модулировать ряд эффектов гормона). С помощью методов гель-фильтрации, электрофоретических методов и анализа аминокислотного и липидного составов модулятор был идентифицирован как гликопротеин с мол. м. 24 кДа, способный связывать меченный ^|251-Т₄ в чрезвы-

Таблица I

Влияние Т₄ и МДТ₄ на синтез белков (включение ¹⁴С-лсйцина в белки в имп/мин на I мг белка) митохондрий печени крыс разного возраста (л = 10; М ± т)

Г1 р им ечание. Здесь и табл. 2 достоверность различий по сравнению с контролем: одна звездочка — р > 0,01, две — р> 0,001.

Таблица 2

Влияние Т₄ и МДТ₄ на синтез белков (включение ^,4С-лсйцина в белки в имп/мин на 1 мг белка) митохондрий головного мозга крыс разного возраста (л — 10; М ± т)

чайно низких концентрациях (К_а 1,3-10¹⁰ М¹) [б].

Добавление модулятора, выделенного из клеток интактных крыс всех возрастов, приводило к незначительному изменению включения метки в белки митохондрий. Совместная преинкубация физиологической концентрации Т₄ с таким модулятором вызывала существенную стимуляцию биосинтеза белков митохондрий во все исследованные сроки развития, причем эта стимуляция увеличивается с возрастом животных и достигает максимума (294% стимуляции) у 90-дневных крысят. Аналогичная закономерность сохранялась и в случае, когда мо-

Динамика активности МДТ₄ в печени (/) и головном мозге (2) крыс разного возраста.

По оси ординат - активность модулятора, изменения синтеза белков митохондрий (в % к контролю); по оси абсцисс - дни развития.

дулятор выделяли из печени гипертиреоидных эмбрионов и крыс. В этой серии экспериментов проводили также перекрестные эксперименты, в которых к митохондриям печени эмбрионов и крысят в среду инкубации добавляли модулятор, выделенный из клеток головного мозга гипсртирсоид- ных крыс. Эти эксперименты показали, что МДТ₄, выделенный из головного мозга крыс всех изученных возрастов, почти нс изменял синтеза белков митохондрий печени.

Особый интерес вызывало изучение митохондриального синтеза белков при действии Т₄ и МДТ₄ в клетках головного мозга (табл. 2). Физиологические концентрации свободного Т₄ так же, как и в печени, почти не изменяют синтеза белков в изолированных митохондриях мозга, тогда как МДТ₄, выделенный из клеток головного мозга интактных крыс и предварительно проинкубированный с Т₄ (IO^-8 М), а также модулятор из клеток гипертиреоидных крыс стимулируют включение меченого лейцина в белки митохондрий у эмбрионов, 7- и 20-дневных крысят. В дальнейшие сроки развития стимуляция синтеза белков снижается и у 90-дневных крысят возвращается к контрольному уровню. Идентичные результаты были получены при проведении перекрестных экспериментов (митохондрии мозга + модулятор из печени гипертиреоидных крыс).

Если активность модулятора выражать в его способности изменять включение меченых аминокислот в белки митохондрий, можно проследить динамику изменений активности МДТ₄ в

печени и головном мозге крыс в различные сроки пре- и постнатального развития крыс (см. рисунок). Из рисунка видно, что активность модулятора меняется в печени и головном мозге в зависимости от возраста по-разному. В печени повышение активности МДТ4 прямо коррелирует с возрастом животного, а в клетках головного мозга наибольшая активность модулятора обнаруживается у эмбрионов и крысят, не достигших месячного возраста.               •

Полученные в этой серии результаты совпадают с литературными данными о том, что в ранние постнатальные сроки у крыс происходит максимальное связывание в цитоплазме Т4 с соответствующими рецепторами |7, 8]. По-видимому, такая динамика обеспечивает поступление необходимого количества гормона в период, когда имеется наибольшая потребность в нем для развития мозга. Во взрослом организме чувствительность мозга к действию Т4 снижается и, очевидно, это связано со снижением активности модулятора.

Известно, что важнейшим показателем действия тиреоидных гормонов является увеличение основного обмена, “калоригенный” эффект гормонов щитовидной железы, сопровождающийся повышенным потреблением различными тканями кислорода и увеличением в этих тканях синтеза белков [2, 18]. Но не все органы отвечают усилением энергетического метаболизма (например, ЦНС) [7]. Эти данные указывают на то, что гормоны щитовидной железы дают множественные и различные эффекты в тканях. Это различие проявляется также в ответе некоторых ферментных систем клеток. Так, при гипертиреозе активность а-глицерофосфатдегидрогеназы в печени повышается в 20 раз, при гипотиреозе активность этого фермента снижается. В то же время при гипертиреозе в мозговой ткани не наблюдается заметных изменений в активности а-глицерофосфатдегидрогеназы 114].

По мнению некоторых авторов 117], дифференцированный ответ органов на действие тиреоидных гормонов обусловлен различиями в содержании ядерных Т₃-рецепторов. Ими обнаружена высокая корреляция между метаболическим ответом разных органов на действие гормонов щитовидной железы и Т₃-связывающей емкостью ядерных рецепторов этих органов.

В то же время установлено, что в онтогенезе имеется период, когда тиреоидные гормоны абсолютно необходимы для развития мозга. Это поздний эмбриональный и неонатальный периоды жизни у людей и первые 2-3 нед постнатальной жизни у крыс, кроликов и кошек [9]. Клинически [24] и экспериментально 115 ] установлено, что недостаток тиреоидных гормонов в этот период приводит к структурным и функциональным изменениям ЦНС. Введение тиреоидных гормонов в этот период нормализует развитие ЦНС. Чем вызвана различная возрастная чувствительность мозга к тиреоидным гормонам, остается неясным. На основании данных литературы и результатов наших экспериментов можно предположить, что в механизме тканеспецифического влияния тиреоидных гормонов и формирования возрастной чувствительности к действию этих гормонов принимают участие цитоплазматические Т4-связывающие белки типа модулятора.

В ы в о д ы

1. Для реализации действия физиологической концентрации Т4 на синтез белков изолированных митохондрий печени крыс разного возраста необходимо участие цитоплазматического МДТ4.
2. Изменение активности МДТ4 в печени прямо пропорционально увеличению возраста крыс и совпадает с калоригенным эффектом гормона в этом органе.

• В клетках головного мозга максимальная активность модулятора приходится на поздний эмбриональный и ранний постнатальный (до 25-го дня жизни) периоды развития крыс.