Регуляция хорионическим гонадотропином уровня внутриклеточного калия в иммунокомпетентных клетках крови человека; роль фаз менструального цикла

Во время беременности, помимо гормональных перестроек, в организме матери происходят суще­ственные изменения иммунной системы [6]. В свя­зи с тем что клетки плода экспрессируют на своей поверхности антигены отцовского гаплотипа, они как генетически чужеродные одновременно явля­ются потенциальной мишенью для цитотоксиче­ского ответа со стороны иммунной системы мате­ри. Однако этого не происходит отчасти благодаря синтезу ряда плацентарных гормонов [ 1 ]. Наиболее важным гормоном, определяющим развитие бере­менности и контролирующим синтез половых сте­роидов, является хорионический гонадотропин (ХГ). Этот гликопротеин продуцируется главным образом синцитиотрофобластом плаценты и обла­дает широким спектром действия как на репродук­тивные ткани [9], так и на клетки иммунной сис­темы [1, 5]. Ранее показано, что молекулярные ме­ханизмы внутриклеточной трансдукции гормо­нального сигнала на уровне иммунокомпетентных клеток реализуются через сАМР-и Са²⁺-зависимые пути [5]. Известно, что эти системы участвуют и в регуляции К⁺-гомеостаза клетки, который является ключевым фактором активации и пролиферации лейкоцитов [8, 12]. Функционирование различных К⁺-каналов, определяющих уровень внутриклеточ­ного содержания К⁺([К⁺]_;), подвержено влиянию половых стероидных гормонов [10], которые спо­собны регулировать иммуномодулирующие эффек­ты ХГ [5]. Уровни половых стероидов в крови раз­личаются в течение менструального цикла: эстро­гены преобладают в фолликулярной (эстрогендо- минантной) фазе, прогестины — в лютеиновой (прогестерондоминантной) фазе. Поскольку из­вестно, что направленность иммуномодулирующих эффектов ХГ определяется половыми стероидами и типом гормонакцептирующих клеток [5], необ­ходимо учитывать обе эти составляющие.

Целью данной работы была оценка влияния ХГ на уровень [K⁺]j в различных по функциональной значимости иммунокомпетентных клетках перифе­рической крови человека с учетом фаз менструаль­ного цикла.

Материалы и методы

В работе использовали клетки периферической крови здоровых доноров: женщин, находящихся в поздней фолликулярной (эстрогендоминантной) и поздней лютеиновой (прогестерондоминантной) фазах менструального цикла, и мужчин (контроль­ная группа). Мононуклеары выделяли на градиенте плотности фиколла—верографина (1,077 г/мл), по­сле чего моноциты и лимфоциты подвергали фрак­ционированию. Для этого суспензию после двой­ной отмывки питательной средой 199 ("Биомед”, Россия) помещали на стеклянные чашки Петри ("Anumbra”) с 5% эмбриональной телячьей сыво­роткой ("Sigma”, США) и инкубировали 45 мин при 37°С. Затем фракцию, обогащенную лимфоцитами, сливали, а прилипшие моноциты снимали с помо­щью резинового шпателя. Фракционированные клетки двукратно отмывали в среде 199 и инкуби­ровали 45 мин при 4°С для стабилизации мембран­ных структур. Чистота выделения моноцитов по оценке иммунофлюоресцентным методом с ис­пользованием моноклональных антител к CD14 (Primary Anti-Human CD14; clone 2С-15С, ICN, США) составляла 78—85%. Чистота выделения лимфоцитов оценивалась при подсчете мазков, ок­рашенных азуром и эозином, и составляла 85— 90%. Сепарированные таким образом моноциты и лимфоциты в концентрации 2 • 10⁶ в 1 мл преинку - бировали с ХГ ("Profasi Serono", Италия) в течение 10, 30 и 60 мин при 37°С. Гормон использовали в концентрациях 10, 50 и 100 МЕ/мл, соответствую­щих его физиологическим уровням в крови во вре­мя беременности |2]. Затем для определения уров­ня [K⁺]j клетки отмывали в инкубационной среде 199 и холодном изотоническом растворе MgCl₂ (95 мМ), пермеабилизировали 1% тритоном Х-100 ("Serva", США) и осаждали центрифугированием [13]. Уровень [K^Jj в клеточных супернатантах оп­ределяли на пламенном фотометре ФПЛ-1 (Рос­сия), результаты выражали в микромолях на 10⁶ клеток. Жизнеспособность фракционированных клеток, которую оценивали на каждом этапе экс­перимента в тесте с эозином, составляла 95—98%. Статистическую обработку результатов после пред­варительной оценки распределения проводили с использованием критерия U Манна—Уитни — па­кет Statistica (Stat Soft, США, 1999). За статистиче­ски значимые принимали различия при р < 0,05.

Результаты и их обсуждение

В динамике 60-минутного культивирования ин­тактных моноцитов выявлено статистически зна­чимое снижение уровня [К⁺]_; в клетках женщин, находящихся в фолликулярной фазе менструально­го цикла, тогда как в клетках женщин, находящих­ся в лютеиновой фазе, и в клетках мужчин уровень [К⁺]. существенно не изменялся (табл. 1). Таким образом, уровень [К?ф в интактных клетках, по-ви- димому, в определенной степени зависит от уровня половых стероидных гормонов.

При внесении ХГ в культуру моноцитов мужчин эффект вызывает только высокая доза гормона (100 МЕ/мл), которая индуцирует значимое снижение уровня [К⁺]₄ к 30-й минуте культивирования по от­ношению к 10-й минуте, а также относительно до­зы 50 МЕ/мл. В клетках женщин, находящихся в фолликулярной фазе менструального цикла, высо­кие дозы гормона не вызывают подобного эффек­та, но стабилизируют уровень [K⁺]j относительно контроля в динамике культивирования. При инку­бации с ХГ моноцитов женщин, находящихся в лютеиновой фазе цикла, гормон не оказывает мо­дулирующего влияния на уровень [К?ф (см. табл. 1).

Известно, что при рецепции ХГ клетками Лей­дига повышается уровень внутриклеточного Са²⁺ ([Ca²⁺]j) и включаются Са²⁺-активируемые К⁺-ка- налы, что приводит к выходу К⁺ из клетки [7]. Так­же при увеличении уровня [Са²⁺]₄ в человеческих макрофагах активируются Са²⁺-зависимые К⁺-ка- налы, определяющие выход ионов К⁺ |11]. Воз­можно, подобный механизм действия ХГ реализу­ется и в моноцитах периферической крови мужчин. Поскольку функциональная активность моноци­тов во многом зависит от деятельности Са²⁺-акти- вируемых, потенциалзависимых и АТФ-чувстви- тельных К⁺-каналов, определяющих уровень [К?], в клетках [3], его снижение под воздействием ХГ мо­жет служить одним из механизмов, с помощью ко­торого гормон регулирует активность фагоцитов. Разнонаправленность действия ХГ на уровень [K⁺]j в женских клетках в зависимости от фазы менстру­ального цикла скорее всего связана с уровнем по­ловых стероидов, доминирующих в каждой фазе. По-видимому, в моноцитах женщин поздней фол­ликулярной фазы цикла эстрогены и фолликуло­стимулирующий гормон (ФСГ) способствуют ста­билизации уровня [К⁺], под действием ХГ, тогда как в моноцитах лютеиновой фазы под действием прогестерона эффекты ХГ трансформируются.

Табл и ца 1

Влияние ХГ на уровень [K⁺]i (в мкМ на 10⁶ клеток) в моноцитах периферической крови человека (М ± т)

Примечание. Здесь и в табл. 2: п — число исследований; значимые различия: а — по сравнению с 10-й минутой инкубации; б — по сравнению с предыдущей дозой ХГ; в — по сравнению с соответствующим контролем.

В условиях 60-минутного культивирования ин­тактных лимфоцитов уровень [K⁺]j значимо снижа­ется в клетках женщин, находящихся в фоллику­лярной фазе овариального цикла, тогда как в лим­фоцитах женщин, находящихся в лютеиновой фа­зе, и в клетках мужчин уровень [К⁺], остается не­изменным (табл. 2). Таким образом, изменения уровня [К?], в лимфоцитах периферической крови имеют тот же характер, что и в моноцитах, и также подвержены влиянию половых стероидных гормо­нов.

В лимфоцитах мужчин, как и в моноцитах, эф­фект вызывает только высокая доза ХГ (100 М Е/мл), под действием которой уровень [ К/], статистически значимо снижается к концу 60-минутной инкуба­ции по отношению к 10-й минуте. В лимфоцитах женщин, находящихся в фолликулярной фазе ова­риального цикла, гормон стабилизирует уровень [K⁺]j в динамике культивирования только в дозе 50 МЕ/мл. При этом, хотя динамика изменений уров­ня [K⁺]j под действием дозы 10 МЕ/мл не отлича­лась от таковой в группе сравнения, этот показа­тель на 60-й минуте культивирования был значимо выше контрольного (см. табл. 2). В культуре лим­фоцитов женшин, находящихся в лютеиновой фазе цикла, на 30-й минуте культивирования ХГ в дозе 50 МЕ/мл статистически значимо снижает уровень [K⁺]j относительно контроля. К концу инкубации данный эффект не наблюдается, но фиксируются статистически значимые различия уровней [К⁺]_{ при исследованных дозах гормона (см. табл. 2).

Таким образом, способность ХГ снижать уро­вень [К?], как в моноцитах, так и в лимфоцитах мужчин можно с определенной долей вероятности интерпретировать как самостоятельный, не завися­щий от женских половых стероидных гормонов эф­фект ХГ. Ранее показано, что ХГ в высокой дозе способен угнетать функциональную активность Т- лимфоцитов, повышая внутриклеточные концен­трации сАМР [4] и Са²⁺ [4, 5]. Известно, что уве­личение уровня сАМР способно активировать не­которые потенциалзависимые [15] и сАМР-чувст- вительные К⁺-каналы [14], а повышение уровня [Са²⁺]_{ — Са²⁺-зависимые К⁺-каналы, что в сово­купности и может обусловить снижение уровня [К% в лимфоцитах мужчин под действием высокой дозы ХГ.

В лимфоцитах женщин, находящихся в эстро- гендоминантной фазе овариального цикла, как и в моноцитах, К⁺-потенцируюший эффект гормона, по-видимому, обусловлен влиянием эстрогенов и ФСГ. Однако в лимфоцитах лютеиновой фазы в от­личие от моноцитов эндокринный фон способст­вует ХГ-зависимому понижению уровня [К⁺|_?

Из литературы [10] известно, что прогестерон, доминирующий в лютеиновой фазе, обладает вы­сокой аффинностью к Са²⁺-активируемым и по- тенциал-чувствительным К⁺-каналам Т-лимфоци­тов и способен прямо и обратимо их блокировать, приводя к стабилизации уровня [К⁺]_;. По-видимо­му, ХГ ослабляет К⁺- блокирующий эффект про­гестерона, в результате чего уровень [К⁺]_{ в лимфо­цитах, оставаясь стабильным в динамике, снижает­ся относительно контрольного уровня. Таким об­разом, ХГ и прогестерон выступают антагонистами на уровне системы К⁺-транспорта, поэтому в лю­теиновой фазе ХГ не реализует свое собственное действие и препятствует проявлению эффекта по­ловых стероидов.

Таблица 2

Влияние ХГ на уровень [K⁺]i (в мкМ на 10⁶ клеток) в лимфоцитах периферической крови человека (М ± /и)

Продолжительность инкубации, мин

Примечание, г — различия по сравнению с 30-й минутой инкубации.

Во время беременности ХГ угнетает иммунные реакции матери, направленные на отторжение по- луаллогенного плода [1]. Поскольку трансдукция гормонального сигнала осуществляется с помощью аденилатциклазной и Са²⁺-зависимой систем вто­ричных мессенджеров [4, 5], связанных с ^-транс­портом клеток [14], модуляция ХГ уровня [К⁺]; в иммуноцитах, по-видимому, может быть еще од­ним механизмом реализации эффектов гормона. Половые стероиды, в частности прогестерон, пре­обладающий при беременности, наряду с регуля­цией других эффектов ХГ [5] — способны оказы­вать влияние и на К⁺-модулирующее действие гор­мона. Таким образом, регуляция ХГ уровня [К⁺]₍ в иммунокомпетентных клеток может быть включе­на в спектр механизмов, обеспечивающих нор­мальное протекание беременности.

Выводы

1. ХГ способен модулировать уровень [K⁺]_i в мо- нонуклеарных клетках периферической крови че­ловека только в высоких концентрациях (50—100 МЕ/мл) в зависимости от пола и фазы менструаль­ного цикла.
2. В моноцитах и лимфоцитах женщин, находя­щихся в фолликулярной фазе овариального цикла, ХГ в высоких концентрациях приводит к стабили­зации уровня [K⁺]j в динамике 60-минутного куль­тивирования.
3. Инкубация in vitro лимфоцитов женщин, на­ходящихся в лютеиновой фазе менструального цикла, с ХГ (50 МЕ/мл) на 30-й минуте приводит к снижению уровня внутриклеточного К⁺.
4. В моноцитах и лимфоцитах мужчин высокая доза ХГ (100 МЕ/мл) снижает уровень [К⁺]| в ди­намике 60-минутной инкубации.