Гиперпролактинемия с преобладанием высокомолекулярного иммунореактивного пролактина: различие в регуляции уровня высокомолекулярной и мономерной форм в крови

Одним из важных биохимических свойств гипофизарного белкового гормона пролактина, вовлекающегося в регуляцию процессов репродукции, является его молекулярный полиморфизм [2]. При гель-фильтрации сыворотки крови людей иммунореактивный пролактин разделяется на три фракции или формы с различной мо-

Таблица 1

Соотношение молекулярных форм иммунореактивного пролактина (иПРЛ) в еыворотке крови обследованных женщин

лекулярной массой 2 3 кД (23К.) , ~ 5 0 кД (50К) и выше . 155 кД (155К) [2, 8, 11]. 22К пролактин предетавляет еобой физиологичееки наиболее активную мономерную молекулярную форму, которая у большинства людей соетавля- ет доминирующую чаеть иммунореактивного гормона в крови. У женщин репродуктивного возраста етойкое повышение уровня пролактина в крови главным образом за счет мономерной формы приводит, как правило, к развитию кли- ничеекого еиндрома переиетирующей галак- тореи-аменореи, гипогонадизму, бееплодию [5, 6].

Две другие иммунореактйвные формы пролактина — 50К и 100К — обычно выявляются в крови в небольших количеетвах. 50 К пролактин включает в еебя в основном димерные и возможно тримерные молекулярные етруктуры. Биохимичеекая природа выеокомолекулярного пролактина, его проиехождение, физиологичее- кое и патофизиологичеекое значение до наето- ящего времени оетаютея неяеными. Вмеете е тем установлено [2, 11, 12], что в некоторых елучаях гиперпролактинемии, а иногда и нормопролак- темии в крови может преобладать не мономерная, а выеокомолекулярная форма пролактина. В таких елучаях у женщин нередко отеутетвуют или очень елабо выражены типичные проявления гиперпролактинемичеекого еиндрома — га- лакторея и нарушения менетруального цикла. Нами показано [б], что примерно у 25% обеледованных женщин е гиперпролактемией различного генеза, а также е нормопролактинемичеекой галактореей еодержание выеокомолекулярного пролактина в еыворотке крови может еущеетвен- но превышать еодержание низкомолекулярной формы.

В наетоящей работе е целью выяенения вза- имоевязей выеокомолекулярной и мономерной иммунореактивных форм проведено еравнитель- ное изучение влияния фармакологичеекой ети- муляции еекреции пролактина на их уровень в крови при гиперпролактинемии е преобладанием выеокомолекулярной формы. В качеетве ети- мулятора еекреции пролактина иепользовали рецепторный антагониет дофамина метоклопрамид [1, 7].

Материалы и методы

Исследования проводили у 5 женщин репродуктивного возраста с умеренной гиперпролактинемией неясного генеза без типичных клинических признаков заболевания. Все обследованные имели значительное содержание высокомолекулярной формы иммунореактивного пролактина в крови. Для стимуляции секреции пролактина женщинам вводили однократно внутривенно утром натощак 10 мг метоклопрамида (Церукал, Термед", Германия). Кровь для определения общего иммунореактивного пролактина и его форм собирали до, через 15, 30, 60 и 120 мин после введения стимулятора. Относительное содержание форм пролактина с различной молекулярной массой исследовали методом гель-фильтрации [3]. Сыворотку крови, взятой до и в разтичные временные интервалы после введения метоклопрамида, подвергали хроматографии на сефадексе G-1.00 ("Pharmacia”, Швеция) на колонке размером 1,6 х 100 см в 0,1 М аммоний-би- карбонатном буфере со скоростью 12 мл в час. Колонку предварительно калибровали с помощью соединений с известной молекулярной массой: голубой декстран, димерная и мономерная формы свиного пролактина, бихромат калия, меченный ¹²⁵1 высокооцененный пролактин человека. В зависимости от уровня общего иммунореактивного пролактина крови на колонку наносили 2—3,5 мл сыворотки, при низкой концентрации гормона сыворотку большего объема лиофилизировали и для нанесения на колонку растворяли в 2—3 мл буфера хроматографии. С колонки собирали фракции объемом 1,7 мл. Содержание пролактина в сыворотке крови и фракциях, элюировавшихся с колонки, измеряли ра- диоиммунологическим методом с помощью реагентов, полученных в лаборатории и откалиброванных по тест-системе ВОЗ для определения пролактина. Результаты определения выражали в мкЕД/мл (3-й Международный стандарт 84/ 500). Чувствительность анализа составляла 40 мкЕД/мл, коэффициент вариации результатов был в пределах 8^>. Фракции, содержащие иммунореактивный материал со сходной хроматографической подвижностью, объединяли, лиофилизировали и после растворения в небольшом объеме буфера определяли суммарное количество пролактина. Содержание отдельных форм гормона выражали в абсолютных цифрах и процентах от суммарного количества пролактина.

Результаты и их обсуждение

Секреция пролактина гипофизом находитея под сложным контролем гипоталамуеа, в котором принимают участие как пролактинетиму- лирующие, так и пролактинингибирующие факторы [8]. Важнейшим физиологичееким механизмом регуляции еекреции пролактина ечитает- ея ее тоничеекое подавление дофамином. Для еравнительного изучения оеобенноетей дофами- нергичеекой регуляции уровня высоко- и низкомолекулярных форм пролактина в крови была отобрана группа из 5 женщин с идиопатической гиперпролактинемией, относительное еодержание выеокомолекулярного пролактина в еыворотке крови которых составило более 50% (табл. 1). У одной из женщин (№ 1), имевшей в течение 5 лет наблюдения умеренно, но почти постоянно повышенный уровень общего иммунореактивного пролактина в крови, в момент исследования он был в пределах нормы. У всех женщин, несмотря на длительную гиперпролактинемию, таких типичных признаков гиперсекреции пролактина, как галакторея или явное нарушение менетруального цикла, не наблюдалось, что весьма характерно для умеренной ги-

Таблица 2

Изменение уровня общего иммунореактивного пролактина (в мкЕД/мл) в ответ на введение метоклопрамида

перпролактинемии с преобладанием высокомолекулярного пролактйна [3, 6].

У всех 5 женщин введение рецепторного антагониста дофамина метоклопрамида приводило к существенной стимуляции секреции пролактина. Как видно из табл. 2, уровень общего иммунореактивного пролактйна в сыворотке крови обследуемых повышался на пике секреции в 4— 13 раз. Такая величина ответа гипофиза на стимулирующее воздействие метоклопрамида вполне соответствует нормальному состоянию функции гипофиза.

Фракционирование сывороток крови для разделения форм пролактйна по молекулярной массе показало, что у обследованных женщин прирост содержания иммунореактивного гормона в сыворотке крови происходит в основном за счет низкомолекулярной формы. На рис. 1 представлен профиль гель-фильтрации сывороток крови одной из женщин (№ 2) до воздействия стимулятора и во время максимального прироста уровня общего иммунореактивного пролактина крови в крови — через 30 мин после введения метоклопрамида. Можно видеть изменение соотношения высоко- и низкомолекулярных форм в сыворотке крови. На пике стимуляции секреции пролактйна доминирующей становится мономерная 23К форма и резко уменьшается доля высокомолекулярной формы, бывшей до введения метоклопрамида преобладающей. Похожие изменения в соотношении молекулярных форм

Рис. 1. Профиль гель-фильтрации сывороток крови до (7) и через 30 мин после (2) введения метоклопрамида.

На колонку с сефадексом наносили одинаковый (3,5 мл) объем сыворотки крови, взятой у обследуемой женщины № 2 до и после введения метоклопрамида.

По оси ординат — содержание пролактйна во фракциях (в мкЕД/мл); по оси абсцисс — номер фракций.

пролактйна наблюдались у всех 5 обследованных женщин независимо от базального уровня ' суммарного иммунореактивного гормона и степени его повышения в ответ на стимулятор (рис. 2, столбики). С повышением общего содержания пролактйна в сыворотке крови доля в нем высокомолекулярной иммунореактивной формы явно уменьшалась, а доля мономерной — увеличивалась, составляя через 15—30 мин после введения метоклопрамида в большинстве случаев 50—80% иммунореактивного гормона. При этом относительное содержание 50К формы значительно не изменялось и оставалось в сравнении с 23К и 100К формами небольшими — менее 20%. Обращает на себя внимание, что понижение общего уровня иммунореактивного пролактина в сыворотке крови к 60—120 мин после введения метоклопрамида сопровождалось сдвигом соотношения высоко- и ' низкомолекулярной форм в обратном направлении. Вновь заметно нарастала доля высокомолекулярной формы и уменьшалась доля мономерной.

О 75 ЗО 60                            720

Рис. 2. Изменение содержания общего иммунореактивного пролактина (иПРЛ) и его молекулярных форм (кривые) и соотношения форм иПРЛ (столбики) в ответ на введение метоклопрамида у 5 обследованных женщин (№ 1—5).

Формы иПРЛ: общий - I, 100К - II, 50К - III, 23К - IV.

По оси ординат — кривые: содержание иПРЛ (в мкЕД/ мл х 10³), столбики: соотношение 100К (столбики с косой штриховкой), 50К (темные столбики), 23К (столбики с горизонтальной штриховкой) форм (в %); по оси абсцисс — время после введения метоклопрамида (в мин).

№3

- I I I I г

О 70               30        60       720

Оценка абсолютного содержания каждой из форм пролактина (см. рис. 2, кривые) свидетельствует, что в результате снятия дофаминового статуса в крови возрастает уровень всех трех форм гормона, но в очень разной степени. Прирост содержания 23К пролактина во много раз превосходит таковой 100К формы.

Динамика абсолютного содержания высоко-и низкомолекулярной форм в сыворотке крови после введения метоклопрамида, демонстрируемая кривыми на рис. 2, также оказалась различной. Динамика уровня 23К формы и общего иммунореактивного пролактина практически совпадала. Их содержание одновременно достигало максимума через 15—60 мин после введения стимулятора и к 60—120-й минуте значительно снижалось, хотя и оставалось несколько выше исходного. В то же время у 3 из 5 обследованных женщин содержание 100К формы в течение всего 120—минутного периода наблюдения продолжало нарастать (см. рис. 2, № 1—3), а у 2 женщин (см. рис. 2, № 4, 5), достигнув к 60-й минуте максимума, к 120-й минуте уменьшалось, но в значительно меньшей степени, чем содержание 23К формы. Следует отметить, что Т. Bjoro и со- авт. [9] также обнаружили после аналогичной фармакологической стимуляции у 4 обследованных ими женщин с гиперпролактинемией и избытком пролактина с высокой молекулярной массой подобные различия в динамике уровня высоко- и низкомолекулярной форм в сыворотке крови.

В механизмах гипоталамической регуляции секреции пролактина гипофизом наряду с ингибиторным влиянием дофамина предполагается участие ряда других соединений, продуцируемых нейросекреторными клетками гипоталамуса [8]. Одним из них является трипептид тироли- берин, способный усиливать секрецию пролактина клетками гипофиза in vivo и in vitro [4, 8]. I. Fraser и соавт. [11] проведено исследование влияния тиролиберина на содержание иммунореактивного пролактина с различной молекулярной массой в крови у 3 женщин с гиперпролактинемией при избыточном содержании высокомолекулярного гормона. Ими было установлено, что тиролиберин, существенно повышая общий уровень иммунореактивного пролактина и его низкомолекулярной фракции в момент их максимальной реакции на стимулятор, лишь слабо влиял на уровень высокомолекулярной формы. У тех же женщин агонист дофамина бромокриптин при однократном введении вызывал быстрое понижение уровня общего и низкомолекулярного иммунореактивного пролактина в крови, при этом значительно слабее влияя на уровень высокомолекулярного.

Таким образом, результаты, полученные нами в настоящей работе, а также приведенные данные литературы четко свидетельствуют о различии в регуляции уровня высокомолекулярной и мономерной форм иммунореактивного пролактина в крови при гиперпролактинемических состояниях с преобладанием формы с высокой молекулярной массой. Следует подчеркнуть, что высокомолекулярная форма, составляя основную часть иммунореактивного пролактина крови, реагирует значительно слабее, чем мономерная, на принципиально различные стимуляторные или ингибиторные фармакологические воздействия — введение метоклопрамида, тиролиберина или бромокриптина.

Выявленная нами слабая реакция на снижение дофаминергического тонуса со стороны высокомолекулярного пролактина при хорошо выраженной реакции со стороны мономерной формы, составляющей у обследованных женщин только сравнительно небольшую часть общего количества иммунореактивного гормона крови, позволяет предполагать, что в данном случае высокомолекулярный иммунореактивный пролактин или по крайней мере значительная часть его имеет негипофизарное происхождение. Это может означать, что мы имеем дело не с истинной гиперпролактинемией, а с феноменом "кажущейся" гиперпролактинемией, обусловленной присутствием в крови значительного количества некоего специфического крупномолекулярного белка, возможно иммуноглобулина, способного давать иммунохимический эффект присутствия пролактина. Подобный феномен, например, описан для гормона роста. Показано, что в .циркулирующей крови человека может присутствовать специфический иммуноглобулин, взаимодействующий с антителами к гормону роста в тест-системе его иммунохимического. анализа [10]. Интересно, что этот иммуноглобулин проявлял также способность связываться с рецепторами гормона роста адипоцитов.

Из данных, полученных нами, следует, что абсолютное содержание высокомолекулярного пролактина в сыворотке крови под воздействием метоклопрамида все-таки повышалось, хотя в значительно меньшей мере, чем мономера гормона. Это может свидетельствовать о неоднородности фракции пролактина с высокой молекулярной массой и наличии в ее составе определенного количества секретируемого гипофизом гормона. Анализ динамики отдельных молекулярных форм пролактина в сыворотке крови показывает, что содержание мономерной формы достигает своего максимума раньше, чем высокомолекулярной. Отставание в повышении уровня последней можно объяснить тем, что компонент высокомолекулярной фракции, реагировавшей на изменение дофаминергического тонуса, может возникать в результате связывания мономера пролактина с каким-то белком сыворотки, что требует некоторого дополнительного времени. Такая связанная форма гормона может быть более стабильна в крови и исчезать из кровотока позже свободной. Хотя убедительных данных о присутствии белка, связывающего пролактин, в сыворотке крови пока нет: специфический иммуноглобулин, способный ковалентно связывать гликолизированный пролактин, найден в амниотической жидкости [12]. Поэтому исключить такой механизм появления в крови высокомолекулярного иммунореактивного пролактина полностью нельзя. Возможно также, при резком возрастании концентрации мономера пролактина в крови под влиянием стимуляции могут активнее происходить процессы нековалентной или ковалентной (дисульфидной) агрегации его . молекул с образованием высокомолекулярных форм.

В заключение следует еще раз подчеркнуть, - что слабая реакция на воздействие метоклопрамида или других стимуляторов и ингибиторов секреции пролактина со стороны высокомолекулярной формы, обнаруживаемой в некоторых случаях в циркулирующей крови в качестве основной формы суммарного иммунореактивного гормона, говорит скорее всего против ее гипофизарного происхождения.

Выводы

• Стимуляция секреции пролактина рецепторным антагонистом дофамина метоклопрамидом при идиопатической гиперпролактинемии с преобладанием высокомолекулярной иммунореактивной формы гормона сопровождается быстрым значительным повышением уровня общего иммунореактивного пролактина в сыворотке крови, главным образом за счет его низкомолекулярной (мономерной) формы.

2. Высокомолекулярный иммунореактивный пролактин, в отличие от мономерной формы, проявляет слабую реакцию на подавление дофаминергического тонуса.

• Результаты изучения влияния фармакологической стимуляции секреции пролактина на уровень его высоко- и низкомолекулярных иммунореактивных форм в крови при гиперпролактинемии с преобладанием формы с высокомолекулярной массой позволяют предположить разную биохимическую природу этих двух форм и негипофизарное происхождение высокомолекулярной формы или ее основной части2.

² Авторы выражают благодарность канд. биол. наук Н. Б. Смирновой за подготовку реагентов для радиоимму- нологического анализа пролактина и канд. биол. наук Т. В. Горшковой за техническое содействие.