Гипогликемизирующий эффект стрессорных воздействий и их использование для профилактики сахарного диабета в эксперименте

Острое воздействие неблагоприятных факторов окружающей среды на организм теплокровных животных и человека вызывает стереотипную метаболическую реакцию, проявляющуюся гипергликемией, накоплением кетоновых тел в крови, вторичной гиперлипидемией, усилением липолиза, гликогенолиза, глюконеогенеза и повышением потребления кислорода [5, 8]. Описанные сдвиги принято рассматривать как отражение резистентной (гиперкатаболической, калоригенной) стратегии адаптации или стрессорного диабета напряжения. Данный вариант адаптационной стратегии во многом реализуется через активацию 0-адренорецепторов и усиление продукции глюкокортикоидов надпочечниками [5, 8], что сопровождается развитием инсулинорезистентности [1, 12]. Последнее обстоятельство наряду с характером вышеописанных метаболических сдвигов позволяет говорить о гомологичности стрессорного диабета напряжения и diabetes mellitus как нозологической формы. Вместе с тем известно, что 1-часовой иммобилизационный стресс, воспроизводимый после суточной депривации пищи, дает инсулинсенсибилизирующий эффект и приводит к развитию гипогликемии [1]. Установлено также, что хронический холодовой стресс вызывает стойкую гипогликемию и формирование резистентности к диабетогенному действию аллоксана [8, 11]. Очевидная противоречивость приведенных данных литературы не позволяет высказать однозначного суждения о роли стресса в патогенезе сахарного диабета. При этом профилактика diabetes mellitus II типа, развивающегося на фоне непрерывного нарастания проявлений стресса в онтогенезе (гипера- даптоза), рассматривается как один из путей предупреждения гериатрической патологии вообще [2].

Настоящая работа посвящена изучению гипог- ликемизирующего эффекта разнородных стрессовых воздействий и рассмотрению возможности использования этого эффекта для профилактики экспериментального сахарного диабета.

Материалы и методы

Использовали 303 белые беспородные крысы массой 180— 220 г. Животных подвергали острому и хроническому стрессу. В качестве острого стрессорного воздействия применяли 1- и 9-часовую иммобилизацию. Для моделирования хронического стресса использовали 3-кратную иммобилизацию (по 60 мин в сутки) и 3-кратное подкожное введение нейтро- филокина (НК)¹ (абсолютная разовая доза 7 • 10‘⁷ мг). Указанное вещество является секреторным продуктом активированных нейтрофилов [3], обладает прооксидантной активностью и вызывает развитие стресс-синдрома [4].

В отдельных сериях эксперимента иммобилизационный стресс модулировали предварительной 24-часовой депривацией пищи и/или подкожным введением обзидана (пропранолола гидрохлорида, Arzneimittelwerk Dresden GmbH, Германия) в дозе 0,45 мг/кг.

В качестве диабетогенных воздействий применяли внутрибрюшинное введение аллоксана тригидрата ("Lachema". Чехословакия) в дозе 200 мг/кг [9] и подкожное введение пролонгированного глюкокортикоидного препарата кенало- fa C'VEB Berlin-Chemie", Германия) в дозе 2 мг/кг. Индукторы экспериментального диабета, вводили натощак через сутки после завершения хронического стресса. Проявления диабета исследовали через 3 сут после его моделирования с помощью аллоксана и через 4 сут после введения кеналога.

Эффекты изучаемых воздействий оценивали по уровню гликемии, содержанию холестерина (ХС) и триглицеридов (ТГ), иммунореактивного инсулина (ИРИ) и кортизола в сыворотке крови, а также по изменению массы тела, выраженному в процентах от исходного уровня. Дополнительно определяли тяжесть аллоксаниндуцированного повреждения печени, о котором судили по активности аланин- и аспартатаминотрансфераз (АЛТ и ACT соответственно), активности у-глутамилтранспептидазы (ГТП) и коэффициенту де Ритиса (АСТ/АЛТ). Инсулиночувствительность животных оценивали по латентности развития комы после внутривенного введения экзогенного гормона ("Инсулрап SPP”, Плива, Югославия) в дозе 40 ЕД/кг [1].

В отдельной серии экспериментов изучали влияние хронического стресса на гипергликемизирующее и антилиполи- тическое действие а₂-адреномиметика клофелина (сернокислая соль отечественного производства), который вводили подкожно натощак за 30 мин до забоя в дозе 0,009 мг/кг. Содержание глюкозы в сыворотке и плазме крови определяли глюкозооксидазным методом при помощи стандартных наборов реактивов ("Lachema", Чехословакия), концентрацию свободных жирных кислот (СЖК) в плазме крови регистрировали колориметрически [13], содержание гликогена в печени — нефелометрически [14], остальные биохимические параметры определяли на анализаторе фирмы KONE (Финляндия). Уровень ИРИ и кортизола исследовали радиоиммунологически с применением наборов РИО-ИНС- П¹²⁵1 и РИО-КОРТ-1-³Н соответственно, Результаты обработаны статистически, о достоверности различий судили по критерию Стыодента, а также по трем критериям непара-

Гомогенный препарат НК, выделенный совместно с Институтом иммунологии Минмедпрома СССР и Институтом биоорганической химии им. М. М. Шемякина (Москва), был любезно предоставлен профессорами И. И. Долгушиным и А. В. Зурочкой (кафедра микробиологии Челябинского медицинского института).

Таблица 1

Влияние хронического стресса на чувствительность крыс к диабетогенному действию аллоксана

Примечание. Одна звездочка — достоверные различия интактный контроль — аллоксановый диабет, две — аллоксановый диабет — аллоксановый диабет на фоне предварительного стресса.

метрической статистики: Вилкоксона—Манна—Уитни (У), Розенбаума (Q) и точному методу Фишера (ТМФ).

Результаты и обсуждение

Анализируя возможные причины гипоглике- мизирующего действия острого стресса, мы обратили внимание на различия в изменениях уровня глюкозы крови животных, подвергнутых иммобилизации натощак, и без предварительной депривации пищи. Как уже отмечалось ранее, 1-часовая иммобилизация крыс, не получавших пищи в течение суток, вызывает снижение уровня гликемии на 32% [1], в то же время аналогичное стресс-воздействие у неголодавших крыс приводит к увеличению концентрации глюкозы в крови на 12% [с 7,72 ± 0,41 ммоль/л в интактном контроле до 8,65 ± 0,71 ммоль/л через 60 мин после стресса; в обеих группах я — 15, р — 0,05 (2)]. При этом стрессорная гипергликемия у сытых животных реализуется на фоне исходно большего уровня сахара крови, чем у крыс после суточного голодания (6,36 ± 0,29 ммоль/л против 4,64 ± 0,34 ммоль/л, я = 5, в обоих случаях р < 0,01). Таким образом, изначальная гипергликемия усугубляется в ответ на стрессорное воздействие, тогда как относительно низкая концентрация глюкозы в крови претерпевает дальнейшее уменьшение. Описанная закономерность является исключением из правила "исходного фона" Вильдера—Лейтеса и позволяет связать постстрессорную гипогликемию с предшествующим голоданием.

Стрессирование сытых крыс нивелирует гипогликемический эффект последующего стресса натощак. Так, 1-часовая иммобилизация крыс на фоне суточного голодания после аналогичного воздействия без депривации пищи не вызывала значимых изменений уровня сахара в крови (3,65 ± 0,22 ммоль/л у интактных крыс и 3,76 ± 0,32 ммоль/л у стрессированных; я = 7, р > 0,5). Более того, стрессирование сытых крыс в этом же режиме -на протяжении 2 дней (по 1 разу в сутки) и последующая 60-минутная иммобилизация натощак вызывали достоверный прирост уровня гликемии [5,00 ± 0,38 ммоль/л (я = 6) против 3,37 ± 0,32 ммоль/л (я = 7) в контроле; р — 0,01 (0)]. Подобная инверсия гипогликемического эффекта иммобилизации голодных животных может, быть связана со своеобразным перераспределением запасов гликогена из поперечнополосатой мускулатуры в печень во время предварительного стрессирова- ния крыс. Действительно, 1-часовая иммобилизация сытых крыс наряду со снижением содержания гликогена в скелетной мускулатуре на 26,4% [1] вызывала тенденцию к накоплению этого полисахарида в печени [6,56 ± 1,06 г на 100 г ткани (л = 18) в контроле против 7,57 ± 0,91 г на 100 г ткани (я = 16); р > 0,25]. Данный феномен считается следствием трансформации лактата, выделившегося при гликогенолизе и последующем гликолизе в мышечной ткани, в гликоген печени [12]. В связи с изложенным интересно отметить, что введение р-адреноблока- тора обзидана сытым крысам непосредственно перед иммобилизацией препятствует стрессинду- цированному снижению -содержания гликогена в скелетной мускулатуре |1] и одновременно снижает его уровень в печени [5,88 ± 0,83 г на 100 г ткани (я = 11) у крыс, стрессированных на фоне введения 0,9% N3(31, против 3,69 ± 0,88 г на Г00 г ткани (я = 14) у животных, получавших перед иммобилизацией обзидан; р < 0,05 (£/)]. Опираясь на приведенные экспериментальные ’ факты -и данные литературы, можно предположить, что введение обзидана перед каждой из повторных иммобилизаций способно предотвратить отсроченный гипергликемический эффект хронического стресса за счет уменьшения печеночного пула гликогена, который в отличие от мышечного пула является непосредственным источником сахара крови [10]. Справедливость этого предположения иллюстрируется более низким уровнем гликемии при вышеописанном трехкратном режиме - стрессирования на фоне введения обзидана по сравнению с аналогичным воздействием на животных, не получавших адреноблокатора [3,04 ± 0,33 ммоль/л (я = 7) против 5,0 ± 0,38 ммоль/л (я = 6); р < 0,01].

Характер влияния трехкратного предварительного стрессирования крыс на проявления аллоксанового диабета также зависит от введения обзидана, как и уровень гликемии у животных, не получавших аллоксана после завершения серии иммобилизаций. Очевидно (табл. 1), что повторный иммобилизационный стресс в сочетании с введением р-адреноблокатора дает выраженный

Таблица 2

Влияние хронического стресса на чувствительность крыс к инсулину, кеналогу и клофелину

Примечание. Статистическая обработка данных проведена с использованием критериев Вилкоксона—Манна—Уитни и Стыодента. Одна звездочка — достоверные различия интактный контроль — фармакологическое воздействие, две — фармакологическое воздействие — фармакологическое воздействие на фоне предшествующего стресса.

профилактический эффект, а именно: почти в 5 раз снижает уровень аллоксаниндупированной гипергликемии, уменьшает прирост содержания циркулирующих ТГ у больных животных более чем на 60%, достоверно ограничивает гиперфер- ментемию, уменьшение концентрации ХС в сыворотке крови и потерю массы тела. В то же время трехкратный стресс без введения обзидана препятствует лишь уменьшению соотношения АСТ/АЛТ, развитию гипохолестеринемии и снижению массы тела.

Полученные результаты согласуются с представлениями об адаптации к стрессу, сопровождающейся развитием перекрестной резистентности к разнородным повреждающим воздействиям [7]. Так, диабетогенное действие аллоксана реализуется как частное следствие его проок- сидантного эффекта, затрагивающего, наряду с панкреатическими p-эндокриноцитами почки и печень [9, 12]. Поражение последнего органа при введении аллоксана вызывает прирост сывороточной активности ГТП, АЛТ, уменьшение коэффициента АСТ/АЛТ и, по-видимому, нарушение холестеринсинтезирующей функции печени, что проявляется гипохолестеринемией (см. табл. 1). Отсюда профилактическое, диабетпре- дупреждающее действие повторных иммобилизаций вполне можно объяснить известным фактом усиления антиокислительного потенциала при хроническом стрессе |7, 11]. Сочетание стресса с введением обзидана может привести к более выраженной активации свободнорадикального окисления (СРО), поскольку исследованный p-адреноблокатор усиливает продукцию оксидантов макрофагами .[6]. Вполне возможно, что большая продукция интермедиатов СРО вызывает дополнительное усиление мобилизации факторов антирадикальной защиты и обусловливает таким образом максимальную резистентность к аллоксану у крыс, стрессированных на фоне введения обзидана.

В связи с последним предположением интересно заметить, что 3-кратное введение крысам биогенного прооксиданта (НК) вызывает гипогликемию натощак через сутки после заключительной инъекции [2,73 ± 0,23 ммоль/л (и = 14) против 3,56 ± 0,25 ммоль/л (л = 15) в контроле; р < 0,05], а также смягчает проявления аллоксанового диабета, уменьшает гипергликемию и потерю массы тела, индуцированные ке- налогом (см. табл. 1). При этом следует подчеркнуть, что наряду с неспецифическим проокси- дантным действием, считающимся основой стрессогенной активности НК [4], это вещество так же, как обзидан, усиливает продукцию кислородных радикалов мононуклеарными фагоцитами [3].

Рассматривая вероятные механизмы гипогли- кемизирующего и диабетпредупреждающего эффектов изученных воздействий, мы опирались на предположение о p-адренозависимой гиперинсу- линемии при остром стрессе [1]. Прямая экспериментальная проверка показала несостоятельность этого предположения. Так, стрессирование крыс 9-часовой иммобилизацией натощак снижает уровень гликемии с 3,56 ± 0,25 ммоль/л (п = 15) (в контроле) до 1,63 ± 0,29 ммоль/л (п — 12) (р < 0,001), причем уровень ИРИ остается неизменным [15,97 ± 2,35 мкЕД/мл (л = 11) против 13,91 ± 1,82 мкЕД/мл (л = 12); р > 0,05]. В то же время содержание кортизола достоверно увеличивается [121,92 ± 15,31 нмоль/л (л = 12) против 69,0 ± 13,91 нмоль/л (л = 11); р < 0,05 (U)]. Трехкратный 1-часовой иммобилизационный стресс вообще не сопровождается значимыми изменениями сывороточной концентрации обоих гормонов, а 3-разовое введение НК приводит к гипоинсулинемии [11,58 ±1,18 мкЕД/мл (л = 12) против 13,91 ± 1,82 мкЕД/мл (л = 12) в контроле; р < 0,05 (ТМФ)] на фоне прироста уровня кортизола [102,63 ± 12,43 нмоль/л (л = 12) против 69,0 ± 13,91 нмоль/л (л = 11); р < 0,05 (U)]. Описанные эндокринные сдвиги не могут быть причиной снижения уровня сахара в крови и, скорее всего, являются вторичными по отношению к стрессорной гипогликемии, которая сдерживается, в частности, контринсулярными эффектами кортизола. При этом все изученные варианты хронического стресса оказывают инсулинсенсибилизирующее действие, т. е. снижают латентность развития комы при введении экзогенного гормона (табл. 2). Таким образом, полученные данные позволят предположить, что гипогликемизирующий и антидиабетический эффекты разнородных экстремальных воздействий реализуются вследствие угнетения контринсулярных систем, а не прироста циркулирующего инсулина. Данному предположению хорошо соответствует вышеизложенный факт антистероидного действия НК в тесте с кенало- гиндуцированной гипергликемией.

Важно отметить усугубление антилиполи- тического действия клофелина на фоне предварительного иммобилизационного стресса (см. табл. 2). Этот факт может быть причастен к ограничению снижения массы тела при неизменной выраженности гипергликемии у крыс, получавших аллоксан после 3-кратной иммобилизации без введения обзидана (см. табл. 1). Последнее предположение обусловлено сочетанием антилиполитического эффекта а2-адренос- тимуляции с ее глюкагонлибераторным действием и способностью тормозить секрецию инсулина [10, 15], что проявляется гипергликеми- зирующим эффектом клофелина (см. табл. 2). Известно, что накопление циркулирующих ТГ у больных диабетом является вторичным по отношению к приросту уровня СЖК крови, которые утилизируются на синтез ТГ в печени [10]. Поэтому сенсибилизация а2-адренореактивных структур может быть причастна и к ограничению триацилглицеридемии при аллоксановом диабете у крыс, перенесших 3-кратную иммобилизацию с введением обзидана (см. табл. 1).

Факт усиления СЖК-снижающего действия клофелина при хроническом стрессе интересно сопоставить с представлениями . о повышенной мобилизации жирных кислот в патогенезе diabetes mellitus [10]. Как видно (см. табл. 1 и 2), не всегда сенсибилизация стрессированных животных к антилиполитическому эффекту а2-адре- ностимулятора сопровождается гипогликемией и диабетпрофилактическим действием. Более того, 3-кратное введение НК, уменьшающее уровень сахара в крови натощак и при обоих диабетогенных воздействиях, не только не потенцирует антилиполитический эффект клофелина, но и, напротив, препятствует уменьшению уровня СЖК, вызванному а2-адреномиметиком (см. табл. 2). Необходимо добавить, что стрессирование крыс 3-кратным введением ' НК не только препятствует клофелининдуцированному уменьшению концентрации СЖК в крови, но и ограничивает вызванную клофелином гипергликемию (см. табл. 2).

Таким образом, несмотря на известный вклад циркулирующих СЖК в развитие инсулиноре- зистентности и поддержание гипергликемии, сенсибилизация организма к антилиполитическому действию а2-адреностимулятора не играет решающей роли в развитии диабетпротекторного эффекта хронического стресса. По-видимому, ведущее значение в антидиабетических механизмах стресса принадлежит его гипогликеми- зирующему эффекту, наличие которого, даже в случае параллельной блокады а2-адренозависи- мого контроля уровня СЖК в крови, предупреждает развитие diabetes mellitus в эксперименте.

Выводы

1. Направленность изменений гликемии при остром стрессе определяется предшествующим режимом приема пищи. Стрсссирование животных после 24-часового голодания ведет к гипогликемии, аналогичное стресс-воздсйствис у сытых животных вызывает гипергликемию.
2. Предварительное стрессирование сытых животных отменяет гипогликемизирующий эффект стресса натощак. При 2-кратном воспроизведении данного предварительного воздействия последующий стресс натощак вызывает гипергликемию, которая нивелируется в случае сочетания стрессорных воздействий с фармакологической блокадой p-адренорецепторов.

• Хронический стресс, предшествующий введению аллоксана, уменьшает потерю массы тела и гипохолестеринемию, но не корригирует гипергликемию при экспериментальном сахарном диабете. Блокада p-адренорецепторов обзиданом оптимизирует профилактическое действие стресса, что проявляется сопутствующим уменьшением гипергликемии и гипертриглицеридемии.
• Стрессиндуцированная' сенсибилизация (^-адренозависимого антилиполитического механизма ведет к уменьшению потери массы тела и смягчению триглицеридемии, но не влияет на уровень гликемии у животных, больных диабетом.