Preview

Проблемы Эндокринологии

Расширенный поиск

Комплементнезависимая антитиреоидная цитотоксичность сывороток больных с аутоиммунными заболеваниями щитовидной железы

https://doi.org/10.14341/probl11510

Полный текст:

Аннотация

На первичной культуре тироцитов, изолированных из околоузловой ткани эутиреоидного узлового зоба, показано, что сы­воротки больных с тиреоидитом Хашимото и болезнью Грейвса обладают комплементнезависимой цитотоксичностью. Этот эффект выявлен примерно в 40% сывороток больных, находившихся на разных стадиях медикаментозной компен­сации аутоиммунных заболеваний щитовидной железы. На первичной культуре кожных фибробластов человека цитоток­сический эффект сывороток не проявлялся. Частота выявления комплементнезависимой цитотоксичности в сыворотках больных с тиреоидитом Хашимото и болезнью Грейвса совпадала с частотой обнаружения повышенных уровней раство­римого лиганда FAS-рецептора в соответствующих сыворотках. Тироциты, изолированные из щитовидной железы при болезни Грейвса, оказались резистентными к действию 60% цитотоксических сывороток. Эту резистентность можно связать с найденной в специальных исследованиях сниженной экспрессией FAS-рецептора на таких клетках.

Для цитирования:


Крайнова С.И., Крюкова И.В., Мкртумова Н.А., Кушлинский Н.Е., Антонова С.С., Юшков П.В., Кандрор В.И. Комплементнезависимая антитиреоидная цитотоксичность сывороток больных с аутоиммунными заболеваниями щитовидной железы. Проблемы Эндокринологии. 2004;50(5):7-11. https://doi.org/10.14341/probl11510

For citation:


Krainova S.I., Kryukova I.V., Mkrtumova N.A., Kushlinskii N.E., Antonova S.S., Yushkov P.V., Kandror V.I. Complement-independent antithyroid cytotoxicity of sera of patients with autoimmune thyroid diseases. Problems of Endocrinology. 2004;50(5):7-11. (In Russ.) https://doi.org/10.14341/probl11510

Ранее было показано, что около 80% сывороток больных с аутоиммунными заболеваниями щито­видной железы (АИЗЩЖ) — диффузным токсиче­ским зобом (ДТЗ) и хроническим лимфоцитарным тиреоидитом (ХЛТ) — обладают способностью ин­дуцировать in vitro гибель "нормальных" тироцитов

‘Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ (грант № 02-04-48294).

(изолированных из околоузловой ткани щитовид­ной железы больных с эутиреоидным узловым зо­бом) [3—5]. Поскольку сыворотки больных почти в 90% случаев содержали комплементфиксирующие антитела к микросомальному тиреоидному антиге­ну (тиреоидной пероксидазе — ТПО) [3], а к сыво­роткам предварительно добавляли комплемент, мы отнесли их эффект на счет антителозависимой комплементопосредованной цитотоксичности (АЗКОЦ). При дальнейшем анализе полученных данных выяснилось, однако, что цитотоксической активностью обладали не все сыворотки, содержа­щие антитела к ТПО. Более того, такую активность проявляли и сыворотки, в которых соответствую­щие антитела отсутствовали [5]. Таким образом, нельзя было исключить возможность опосредова­ния цитотоксического эффекта сывороток другими факторами, в частности растворимой формой ли­ганда "рецептора смерти" FAS—sFASL [4, 9]. Пока­зано, что под действием металлопротеиназ этот ли­ганд "слущивается" с поверхности активированных Т-лимфоцитов [15] и может включать программу гибели (апоптоз) клеток, несущих на своей поверх­ности антиген/рецептор FAS [9]. К таким клеткам относятся и тироциты [11].

В предыдущих экспериментах мы нашли также, что 50% заведомо цитотоксических (вызывающих гибель "нормальных" тироцитов) сывороток боль­ных с ДТЗ не оказывали своего лизирующего дей­ствия на клетки, изолированные из ткани ДТЗ, т. е. последние оказались резистентными к АЗКОЦ сы­вороток больных с ДТЗ. Сыворотки больных ХЛТ полностью сохраняли свое цитотоксическое дейст­вие на эти клетки [3—5].

В задачи настоящей работы входило выяснение возможности антитиреоидного цитотоксического действия лишенных комплемента сывороток боль­ных с АИЗЩЖ и сохранения резистентности ти­роцитов из ткани ДТЗ к комплементнезависимой цитотоксичности этих сывороток. Оценивали так­же содержание в них sFASL и растворимой формы FAS-рецептора (sFAS), специфичность цитотокси­ческого эффекта по отношению к тироцитам и экс­прессию FAS и маркера пролиферации Ki-67 на срезах щитовидной железы больных с эутиреоид­ным узловым зобом (околоузловые клетки), ДТЗ и ХЛТ.

Материалы и методы

На антитиреоидную цитотоксичность in vitro тестировали сыворотки крови 92 больных с ДТЗ и 74 больных с ХЛТ, обследованных в терапевтиче­ском отделении (зав. — канд. мед. наук Г. Ф. Алек­сандрова) ЭНЦ РАМН. Диагноз ставили на осно­вании клинических критериев, содержания ТТГ и тиреоидных гормонов в сыворотке больных, ре­зультатов УЗИ щитовидной железы и в ряде случа­ев — ее пункционной биопсии. Возраст больных составлял от 17 до 65 лет. В каждой группе было по­ровну мужчин и женщин, находящихся на разных этапах медикаментозного лечения. Контролем слу­жили сыворотки крови здоровых доноров. "Нор­мальные" тироциты выделяли из околоузловой тка­ни щитовидных желез, полученной при операциях больных с одиночным эутиреоидным узловым зо­бом, и культивировали, как описано ранее [5]. Опе­рации выполняли в хирургическом отделении (зав. — доктор мед. наук Н. С. Кузнецов) ЭНЦ РАМН.

Для инактивации комплемента сыворотки про­гревали 30 мин при 56°С [2]. В лунку 96-луночного плоскодонного планшета вносили по 100 000 кле­ток; через 24 ч надосадочную жидкость убирали, добавляли 30 мкл исследуемой сыворотки и 60 мкл ростовой среды без эмбриональной сыворотки те­ленка. Клетки культивировали 48 ч, затем удаляли надосадочную жидкость с погибшими и распавши­мися клетками, промывали чистой средой 199 и высушивали. Прикрепленные ко дну лунки живые клетки фиксировали этиловым спиртом 20 мин и окрашивали 0,1% раствором азура 30 мин. Для по­лучения гомогенной окраски добавляли этиловый спирт (100 мкл на лунку).

О количестве тироцитов, резистентных к дейст­вию тестируемых сывороток, судили по интенсив­ности окраски клеток (величине оптической плот­ности при D = 594 нм, определяемой на многока­нальном спектрофотометре ЭФОС). Сыворотку считали активной при величине оптической плот­ности, выходящей за пределы —2,5 стандартного отклонения от среднего показателя экстинкции клеток, инкубируемых с контрольными сыворот­ками.

Уровни pFASL и pFas в сыворотках 24 больных с ДТЗ, 27 больных ХЛТ и 5 здоровых доноров оп­ределяли иммуноферментным методом с помощью наборов sFas Ligand ELISA (BMS 260/2) и sAPO-1/ Fas ELISA (BMS 245) соответственно ("Bender MedSystems", Австрия).

Кроме того, исследовали операционный мате­риал от больных, оперированных по поводу ДТЗ и коллоидного зоба на фоне ХЛТ (по 20 больных в каждой группе). Контрольную группу составил ма­териал от 20 больных, оперированных по поводу эутиреоидного узлового коллоидного зоба. Морфо­логически соответствующую возрастной норме ткань брали на расстоянии не менее 1 см от узла. Возраст больных колебался от 27 до 45 лет при оди­наковом соотношении мужчин и женщин во всех группах. Из отобранного материала готовили се­рийные парафиновые срезы, которые окрашивали гематоксилином и эозином по стандартной мето­дике [6]; проводили также иммунопероксидазную реакцию методом ПАП [8]. Для определения FAS- рецептора и маркера пролиферации антигена Ki-67 использовали моноклональные антитела к соответ­ствующим антигенам (фирма "Novocastra", Велико­британия). Результаты иммуногистохимических реакций оценивали полуколичественно, подсчиты­вая число окрашенных клеток (в 10 полях зрения среди 100 произвольно выбранных клеток). При окраске менее 30% тироцитов экспрессию FAS считали слабой, при окраске 31—60% — умеренной и при окраске более 60% — выраженной. Для оцен­ки состояния плазмоцитов клеточного инфильтра­та препараты окрашивали антисыворотками к %- и Х-цепям иммуноглобулинов (моноклональные ан­титела фирмы "Dako", Дания).

Статистическую обработку данных проводили с использованием критерия %2, а также, учитывая близкое к нормальному распределение цифровых показателей, критерия t Стьюдента. Различия счи­тали значимыми при р < 0,05.

Результаты и их обсуждение

Гибель "нормальных" тироцитов in vitro индуци­ровали 33 из 92 лишенных комплемента сывороток больных с ДТЗ (36%) и 28 из 74 сывороток больных ХЛТ (38%). Специфичность данного эффекта в от­ношении клеток щитовидной железы проверяли, исследуя активность сывороток на первичной культуре фибробластов человека (полученной из Института медицинской генетики РАМН). При тестировании 14 сывороток, оказывающих цито­токсическое действие на ’’нормальные” тироциты, гибель фибробластов вызывала только 1 сыворотка. Таким образом, регистрируемый цитотоксический эффект, по-видимому, специфичен именно для клеток щитовидной железы. В противном случае он должен был бы проявляться in vivo деструкцией любых клеток (и в первую очередь эндотелиоци- тов), что, как известно, нехарактерно ни для ХЛТ, ни для ДТЗ [1]. Тот факт, что комплементнезави- симый цитотоксический эффект сывороток боль­ных с АИЗЩЖ выявлялся примерно вдвое реже, чем АЗКОЦ, мог быть связан с разной компенса­цией АИЗЩЖ у больных, от которых такие сыво­ротки были получены.

В любом случае приведенные данные подтвер­ждают присутствие в сыворотках больных с АИЗЩЖ каких-то факторов, которые вызывают гибель тироцитов независимо от комплементфик- сирующих цитотоксических аутоантител. Одним из таких факторов, как отмечено выше, могла быть растворимая форма лиганда ’’смертельного" рецеп­тора FAS—pFASL.

По ряду технических причин цитотоксичность и содержание pFASL исследовали в сыворотках раз­ных больных с АИЗЩЖ. При этом половой и воз­растной состав больных, а также соотношение лиц, находящихся на разной стадии компенсации забо­леваний, в обоих случаях были одинаковыми.

Вопреки предположению, по среднему содержа­нию pFASL сыворотки больных ХЛТ и ДТЗ не от­личались от сывороток здоровых лиц (р > 0,5). Учитывая, однако, что цитотоксический эффект давали не все, а лишь часть сывороток больных с АИЗЩЖ, а также то обстоятельство, что разброс показателей в сыворотках больных значительно превышал таковой в сыворотках здоровых лиц, мы подсчитали число сывороток больных, в которых содержание pFASL существенно (т. е. больше, чем на 3 стандартных отклонения) превышало его сред­ний уровень в контроле (рис. 1).

Оказалось, что концентрация pFASL была су­щественно повышена в 9 из 24 тестированных сы­вороток больных с ДТЗ (37%), на порядок превы­шая норму в этих случаях (0,7 ± 0,3 нг/мл против 0,07 ± 0,01 нг/мл). Из 27 сывороток больных с ХЛТ уровень pFASL существенно превышал норму в 8 (30%). Среднее содержание pFASL в таких сыво­ротках составляло 0,5 ± 0,3 нг/мл. Существенная разница между частотами выявления повышенного уровня этого фактора и средними его концентра­циями при ДТЗ и ХЛТ в таких случаях отсутство­вала (р > 0,4). Важнее отметить, что частота прояв­ления комплементнезависимой цитотоксичности сывороток статистически значимо не отличалась от частоты присутствия в них повышенных концен­траций pFASL (р > 0,3). С нашей точки зрения, совпадение частот обоих показателей в разных пу­лах сывороток может свидетельствовать о важной роли взаимодействия FAS—pFASL в описанном феномене комплементнезависимой антитиреоид-

Рис. 1. Концентрация pFASL (в нг/мл) в сыворотках здоровых лиц и больных с АИЗЩЖ.

Н — здоровые лица; ХЛТ — больные ХЛТ; ДТЗ — больные ДТЗ.

ной цитотоксичности сывороток больных с АИЗЩЖ.

В литературе имеются указания на повышение уровня pFASL в сыворотках больных с нелеченой болезнью Грейвса (ДТЗ) [12]. Найденное нами по­вышение содержания этого фактора лишь в части тестированных сывороток может объясняться не­однородностью группы больных, которые, как уже отмечалось, находились на разной степени ком­пенсации тиреотоксикоза. Сведений о содержании pFASL в сыворотках больных ХЛТ нам обнаружить не удалось.

Не менее важно обратить внимание на практи­чески полное совпадение частот обнаружения ком­плементнезависимой цитотоксичности в сыворот­ках больных ХЛТ и ДТЗ (р > 0,8). Аналогичные данные были получены нами ранее в отношении АЗКОЦ [3—5], однако если цитотоксические свой­ства сывороток при ДТЗ и ХЛТ одинаковы, а мор­фологическая картина ткани щитовидной железы при этих заболеваниях принципиально различна (пролиферация тироцитов при ДТЗ и их деструк­ция при ХЛТ), то следовало предположить сущест­вование при ДТЗ механизмов защиты тиреоидной ткани от цитотоксического эффекта собственных сывороток. При исследовании АЗКОЦ нами были получены подтверждения существования таких ме­ханизмов: многие из тех сывороток, которые вызы­вали гибель "нормальных” тироцитов, оказывались неактивными в отношении клеток ДТЗ [4]. При дальнейшем анализе выяснилось, что резистент­ность этих клеток к АЗКОЦ связана с меньшим присутствием на них поверхностных антигенов, взаимодействующих с антитиреоидными аутоанти­телами [3, 6].

В связи с этим представляло несомненный ин­терес проверить действие лишенных комплемента заведомо цитотоксических сывороток на клетках, изолированных из ткани ДТЗ. Такая проверка по­казала, что из 18 предварительно лишенных ком­племента цитотоксических сывороток лишь 7 со­храняли свою активность на клетках ДТЗ (р < 0,01). Таким образом, подобно тому, что было ранее показано в отношении АЗКОЦ, тироциты из ткани ДТЗ оказались резистентными к 60% цито­токсических сывороток больных с ДТЗ.

По аналогии с тем, что наблюдалось в отноше­нии АЗКОЦ, мы предположили, что и в данном случае резистентность клеток ДТЗ связана с умень­шением на их поверхности экспрессии рецептора APOI (FAS), опосредующего апоптозиндуцирую- щий эффект pFASL, и сравнили его экспрессию на срезах щитовидных желез в "норме", при ДТЗ и ХЛТ.

Группу ДТЗ составили случаи классической диффузной микро-макрофолликулярной гипер­плазии щитовидной железы с резорбцией коллоида и очаговыми лимфоидными инфильтратами в строме. При ХЛТ брали ткань на расстоянии не ме­нее 1 см от коллоидных узлов (атрофический вари­ант с диффузно-очаговой лимфоидной инфильтра­цией стромы и формированием лимфоидных фол­ликулов со светлыми центрами). Паренхима щито­видной железы в данных случаях была представле­на в основном мелкими фолликулами с уплощен­ным (атрофичным) эпителием.

В относительно неизмененной тиреоидной тка­ни ("норма") экспрессия FAS была умеренной, т. е. он обнаруживался на мембране в среднем 32% кле­ток. При ХЛТ экспрессия маркера апоптоза была выражена в гораздо большей степени. В 17 из 20 случаев число окрашенных на FAS паренхиматоз­ных клеток превышало 60% (рис. 2, см. на вклей­ке), причем вокруг таких клеток в большом коли­честве присутствовали плазмоциты, дающие реак­цию на цепи иммуноглобулинов. Там же, где име­лись очаги пролиферации фолликулярных клеток и слабая инфильтрация плазмоцитами, экспрессия FAS была существенно слабее (окрашивались 27— 34% тироцитов). В отличие от этого в ткани ДТЗ экспрессия FAS, как правило, была очень слабой. Меньшую экспрессию FAS фолликулярными клет­ками при ДТЗ по сравнению с ХЛТ отмечали и дру­гие авторы [13]. Однако сравнение ткани ДТЗ с нормальной тиреоидной тканью, по-видимому, не проводили.

Таким образом, обнаруженная нами резистент­ность клеток ДТЗ к цитотоксическому действию лишенных комплемента и содержащих pFASL сы­вороток больных с АИЗЩЖ действительно может быть следствием меньшей экспрессии FAS такими клетками.

Что касается ядерного маркера пролиферации Ki-67, то, как и следовало ожидать, он выявлялся в клетках при ХЛТ реже (в среднем в 20% тироци­тов), а при ДТЗ — гораздо чаще (81%), чем в клет­ках "нормальной" ткани щитовидной железы (27%).

В клетках обнаружена мРНК FAS, кодирующая растворимую форму этого антигена — pFAS, не со­держащую трансмембранного домена. Предполага­ется, что pFAS, "отвлекая на себя" соответствую-

Уровни pFAS в сыворотках больных с АИЗЩЖ (М ± т)

Обследуемые

Уровень pFAS, пг/мл

Значимость различий

Здоровые (л = 5)

219,2 ± 33,4

Л = 0,7

Больные с ДТЗ (п = 24)

267,5 ± 59

Pi = о,з

Больные ХЛТ (п = 27)

188 ± 12,5

Рз = 0,2

Примечание, р, — значимость различий между здоро­выми лицами и больными с ДТЗ; р2 между здоровыми лицами и больными ХЛТ; р} — между больными с ДТЗ и ХЛТ.

щий лиганд, защищает клетки-мишени от апопто- зиндуцирующего действия последнего [10]. Ряд ав­торов обнаружили повышенное содержание pFAS в сыворотках больных с нелеченой болезнью Грейв­са; антитиреоидная терапия приводила к сниже­нию его уровня. При гипотиреозе на фоне ХЛТ уровень pFAS был снижен [12]. В свете этих данных представляло интерес оценить концентрацию pFAS в исследуемых нами сыворотках. Полученные дан­ные приведены в таблице.

Нам не удалось обнаружить сколько-нибудь значимых различий в уровне pFAS между сыворот­ками больных и здоровых лиц. Ни в одном случае его содержание при ДТЗ или ХЛТ не выходило за пределы 3 стандартных отклонений от средней его концентрации в норме. Даже если допустить при ДТЗ повышение уровня pFAS в сыворотках, этим невозможно объяснить выявленную нами "защи­щенность" тироцитов из ткани ДТЗ от цитотокси­ческого действия соответствующих сывороток. Действительно, как показано выше, причина рези­стентности таких клеток кроется отнюдь не в сы­воротках (иначе они должны были бы вызывать ги­бель "нормальных" тиреоидных клеток с той же частотой, что и клеток из ДТЗ), а в самих гипер­плазированных клетках щитовидной железы.

Согласно данным С. Giordano и соавт. [11], экс­прессия FAS тироцитами стимулируется продукта­ми определенных субпопуляций активированных Т-лимфоцитов, "населяющих" щитовидную железу при ее аутоиммунных заболеваниях. Найденное нами снижение экспрессии FAS фолликулярным эпителием при ДТЗ может указывать на различие популяций инфильтрирующих щитовидную железу лимфоцитов при ДТЗ и ХЛТ [4]. Действительно, как было показано ранее в опытах in vitro [5], лим­фоциты из ткани ДТЗ не только не индуцируют ги­бель "нормальных" тироцитов, но, напротив, спо­собствуют их пролиферации и снижают их способ­ность связывать антитиреоидные антитела.

В заключение необходимо подчеркнуть, что предположение о зависимости цитотоксического эффекта сывороток больных с АИЗЩЖ от повы­шенного содержания в них pFASL оставляет от­крытым вопрос о существовании и характере меха­низмов, определяющих специфичность действия pFASL в отношении тироцитов.

Выводы

  1. Почти в 40% сывороток больных с ДТЗ и ХЛТ (находящихся на разных этапах медикаментозного лечения) присутствуют независимые от компле­мента факторы, индуцирующие in vitro гибель "нормальных" (изолированных от околоузловой ткани эутиреоидного узлового зоба) тироцитов.
  2. Цитотоксический эффект сывороток больных с АИЗЩЖ не проявляется на первичной культуре фибробластов, что свидетельствует о его специ­фичности в отношении тироцитов.
  3. Частота обнаружения повышенных уровней pFASL в сыворотках больных с АИЗЩЖ совпадает с частотой выявления комплементнезависимой ци­тотоксичности аналогичных сывороток.

Тироциты, изолированные из ткани ДТЗ, ре­зистентны к действию 60% из тех сывороток, кото­рые оказывают цитотоксическое действие на "нор­мальные" тироциты. Эта резистентность связана не с повышением уровня pFAS в соответствующих сыворотках, а с ослабленной экспрессией FAS на мембране клеток.

Список литературы

1. Болезни органов эндокринной системы / Под ред. И. И. Дедова. - М., 2002. - С. 252-334.

2. Иммунологические методы / Под ред. X. Фримеля: Пер. с нем. — М., 1979.

3. Кандрор В. И., Крюкова И. В., Крайнова С. И. и др. // Пробл. эндокринол. — 1997. — Т. 43, № 3. — С. 25-30.

4. Кандрор В. И. // Пробл. эндокринол. — 2002. — Т. 48, № 1. — С. 45-48.

5. Крайнова С. И., Кандрор В. И. // Пробл. эндокринол. — 1993. - Т. 39, № 6. - С. 46-50.

6. Крайнова С. И., Крюкова И. В., Мкртумова Н. А. и др. // Пробл. эндокринол. — 2001. — Т. 47, № 3. — С. 3-5.

7. Микроскопическая техника / Под ред. Д. С. Саркисова, Ю. Л. Перова. — М., 1996.

8. Угрюмое М. В. Современные методы иммуногистохимии и иммуноцитохимии. — М., 1996.

9. Andricuola М., Tsatsuolis А. // Eur. J. Endocrinol. — 2001. — Vol. 144. - Р. 561-568.

10. Cheng J., Zhou T, Liu C. et al. // Science. — Vol. 263. — P. 1759-1762.

11. Giordano C., Stassi G., DeMaria A. et al. // Science. — 1997. - Vol. 275. - P. 960-963.

12. Hiromatsu Y., Bednarczuk T., Soyejima E. et al. // Thyroid. — 1999. - Vol. 9. - P. 341-345.

13. Salmaso C., Bagnasco M., Pesce G. et al. // Ann. N. Y. Acad. Sci. - 2002. - Vol. 966. - P. 496-501.

14. Takeda K, Ohara E., Kaneda T. et al. // Rinsho Byori. — 1999. - Vol. 47. - P. 961-965.

15. Tanaka M., Suda T, Takahashi T, Nagata S. // EMBO J. — 1995. - Vol. 14. - P. 1129-1135.


Об авторах

С. И. Крайнова

ГУ Эндокринологический научный центр РАМН


Россия


И. В. Крюкова

ГУ Эндокринологический научный центр РАМН


Россия


Н. А. Мкртумова

ГУ Эндокринологический научный центр РАМН


Россия


Н. Е. Кушлинский

ГУ Эндокринологический научный центр РАМН


Россия


С. С. Антонова

ГУ Эндокринологический научный центр РАМН


Россия


П. В. Юшков

ГУ Эндокринологический научный центр РАМН


Россия


В. И. Кандрор

ГУ Эндокринологический научный центр РАМН


Россия


Рецензия

Для цитирования:


Крайнова С.И., Крюкова И.В., Мкртумова Н.А., Кушлинский Н.Е., Антонова С.С., Юшков П.В., Кандрор В.И. Комплементнезависимая антитиреоидная цитотоксичность сывороток больных с аутоиммунными заболеваниями щитовидной железы. Проблемы Эндокринологии. 2004;50(5):7-11. https://doi.org/10.14341/probl11510

For citation:


Krainova S.I., Kryukova I.V., Mkrtumova N.A., Kushlinskii N.E., Antonova S.S., Yushkov P.V., Kandror V.I. Complement-independent antithyroid cytotoxicity of sera of patients with autoimmune thyroid diseases. Problems of Endocrinology. 2004;50(5):7-11. (In Russ.) https://doi.org/10.14341/probl11510

Просмотров: 104


ISSN 0375-9660 (Print)
ISSN 2308-1430 (Online)