Комплементнезависимая антитиреоидная цитотоксичность сывороток больных с аутоиммунными заболеваниями щитовидной железы

Ранее было показано, что около 80% сывороток больных с аутоиммунными заболеваниями щито­видной железы (АИЗЩЖ) — диффузным токсиче­ским зобом (ДТЗ) и хроническим лимфоцитарным тиреоидитом (ХЛТ) — обладают способностью ин­дуцировать in vitro гибель "нормальных" тироцитов

‘Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ (грант № 02-04-48294).

(изолированных из околоузловой ткани щитовид­ной железы больных с эутиреоидным узловым зо­бом) [3—5]. Поскольку сыворотки больных почти в 90% случаев содержали комплементфиксирующие антитела к микросомальному тиреоидному антиге­ну (тиреоидной пероксидазе — ТПО) [3], а к сыво­роткам предварительно добавляли комплемент, мы отнесли их эффект на счет антителозависимой комплементопосредованной цитотоксичности (АЗКОЦ). При дальнейшем анализе полученных данных выяснилось, однако, что цитотоксической активностью обладали не все сыворотки, содержа­щие антитела к ТПО. Более того, такую активность проявляли и сыворотки, в которых соответствую­щие антитела отсутствовали [5]. Таким образом, нельзя было исключить возможность опосредова­ния цитотоксического эффекта сывороток другими факторами, в частности растворимой формой ли­ганда "рецептора смерти" FAS—sFASL [4, 9]. Пока­зано, что под действием металлопротеиназ этот ли­ганд "слущивается" с поверхности активированных Т-лимфоцитов [15] и может включать программу гибели (апоптоз) клеток, несущих на своей поверх­ности антиген/рецептор FAS [9]. К таким клеткам относятся и тироциты [11].

В предыдущих экспериментах мы нашли также, что 50% заведомо цитотоксических (вызывающих гибель "нормальных" тироцитов) сывороток боль­ных с ДТЗ не оказывали своего лизирующего дей­ствия на клетки, изолированные из ткани ДТЗ, т. е. последние оказались резистентными к АЗКОЦ сы­вороток больных с ДТЗ. Сыворотки больных ХЛТ полностью сохраняли свое цитотоксическое дейст­вие на эти клетки [3—5].

В задачи настоящей работы входило выяснение возможности антитиреоидного цитотоксического действия лишенных комплемента сывороток боль­ных с АИЗЩЖ и сохранения резистентности ти­роцитов из ткани ДТЗ к комплементнезависимой цитотоксичности этих сывороток. Оценивали так­же содержание в них sFASL и растворимой формы FAS-рецептора (sFAS), специфичность цитотокси­ческого эффекта по отношению к тироцитам и экс­прессию FAS и маркера пролиферации Ki-67 на срезах щитовидной железы больных с эутиреоид­ным узловым зобом (околоузловые клетки), ДТЗ и ХЛТ.

Материалы и методы

На антитиреоидную цитотоксичность in vitro тестировали сыворотки крови 92 больных с ДТЗ и 74 больных с ХЛТ, обследованных в терапевтиче­ском отделении (зав. — канд. мед. наук Г. Ф. Алек­сандрова) ЭНЦ РАМН. Диагноз ставили на осно­вании клинических критериев, содержания ТТГ и тиреоидных гормонов в сыворотке больных, ре­зультатов УЗИ щитовидной железы и в ряде случа­ев — ее пункционной биопсии. Возраст больных составлял от 17 до 65 лет. В каждой группе было по­ровну мужчин и женщин, находящихся на разных этапах медикаментозного лечения. Контролем слу­жили сыворотки крови здоровых доноров. "Нор­мальные" тироциты выделяли из околоузловой тка­ни щитовидных желез, полученной при операциях больных с одиночным эутиреоидным узловым зо­бом, и культивировали, как описано ранее [5]. Опе­рации выполняли в хирургическом отделении (зав. — доктор мед. наук Н. С. Кузнецов) ЭНЦ РАМН.

Для инактивации комплемента сыворотки про­гревали 30 мин при 56°С [2]. В лунку 96-луночного плоскодонного планшета вносили по 100 000 кле­ток; через 24 ч надосадочную жидкость убирали, добавляли 30 мкл исследуемой сыворотки и 60 мкл ростовой среды без эмбриональной сыворотки те­ленка. Клетки культивировали 48 ч, затем удаляли надосадочную жидкость с погибшими и распавши­мися клетками, промывали чистой средой 199 и высушивали. Прикрепленные ко дну лунки живые клетки фиксировали этиловым спиртом 20 мин и окрашивали 0,1% раствором азура 30 мин. Для по­лучения гомогенной окраски добавляли этиловый спирт (100 мкл на лунку).

О количестве тироцитов, резистентных к дейст­вию тестируемых сывороток, судили по интенсив­ности окраски клеток (величине оптической плот­ности при D = 594 нм, определяемой на многока­нальном спектрофотометре ЭФОС). Сыворотку считали активной при величине оптической плот­ности, выходящей за пределы —2,5 стандартного отклонения от среднего показателя экстинкции клеток, инкубируемых с контрольными сыворот­ками.

Уровни pFASL и pFas в сыворотках 24 больных с ДТЗ, 27 больных ХЛТ и 5 здоровых доноров оп­ределяли иммуноферментным методом с помощью наборов sFas Ligand ELISA (BMS 260/2) и sAPO-1/ Fas ELISA (BMS 245) соответственно ("Bender MedSystems", Австрия).

Кроме того, исследовали операционный мате­риал от больных, оперированных по поводу ДТЗ и коллоидного зоба на фоне ХЛТ (по 20 больных в каждой группе). Контрольную группу составил ма­териал от 20 больных, оперированных по поводу эутиреоидного узлового коллоидного зоба. Морфо­логически соответствующую возрастной норме ткань брали на расстоянии не менее 1 см от узла. Возраст больных колебался от 27 до 45 лет при оди­наковом соотношении мужчин и женщин во всех группах. Из отобранного материала готовили се­рийные парафиновые срезы, которые окрашивали гематоксилином и эозином по стандартной мето­дике [6]; проводили также иммунопероксидазную реакцию методом ПАП [8]. Для определения FAS- рецептора и маркера пролиферации антигена Ki-67 использовали моноклональные антитела к соответ­ствующим антигенам (фирма "Novocastra", Велико­британия). Результаты иммуногистохимических реакций оценивали полуколичественно, подсчиты­вая число окрашенных клеток (в 10 полях зрения среди 100 произвольно выбранных клеток). При окраске менее 30% тироцитов экспрессию FAS считали слабой, при окраске 31—60% — умеренной и при окраске более 60% — выраженной. Для оцен­ки состояния плазмоцитов клеточного инфильтра­та препараты окрашивали антисыворотками к %- и Х-цепям иммуноглобулинов (моноклональные ан­титела фирмы "Dako", Дания).

Статистическую обработку данных проводили с использованием критерия %², а также, учитывая близкое к нормальному распределение цифровых показателей, критерия t Стьюдента. Различия счи­тали значимыми при р < 0,05.

Результаты и их обсуждение

Гибель "нормальных" тироцитов in vitro индуци­ровали 33 из 92 лишенных комплемента сывороток больных с ДТЗ (36%) и 28 из 74 сывороток больных ХЛТ (38%). Специфичность данного эффекта в от­ношении клеток щитовидной железы проверяли, исследуя активность сывороток на первичной культуре фибробластов человека (полученной из Института медицинской генетики РАМН). При тестировании 14 сывороток, оказывающих цито­токсическое действие на ’’нормальные” тироциты, гибель фибробластов вызывала только 1 сыворотка. Таким образом, регистрируемый цитотоксический эффект, по-видимому, специфичен именно для клеток щитовидной железы. В противном случае он должен был бы проявляться in vivo деструкцией любых клеток (и в первую очередь эндотелиоци- тов), что, как известно, нехарактерно ни для ХЛТ, ни для ДТЗ [1]. Тот факт, что комплементнезави- симый цитотоксический эффект сывороток боль­ных с АИЗЩЖ выявлялся примерно вдвое реже, чем АЗКОЦ, мог быть связан с разной компенса­цией АИЗЩЖ у больных, от которых такие сыво­ротки были получены.

В любом случае приведенные данные подтвер­ждают присутствие в сыворотках больных с АИЗЩЖ каких-то факторов, которые вызывают гибель тироцитов независимо от комплементфик- сирующих цитотоксических аутоантител. Одним из таких факторов, как отмечено выше, могла быть растворимая форма лиганда ’’смертельного" рецеп­тора FAS—pFASL.

По ряду технических причин цитотоксичность и содержание pFASL исследовали в сыворотках раз­ных больных с АИЗЩЖ. При этом половой и воз­растной состав больных, а также соотношение лиц, находящихся на разной стадии компенсации забо­леваний, в обоих случаях были одинаковыми.

Вопреки предположению, по среднему содержа­нию pFASL сыворотки больных ХЛТ и ДТЗ не от­личались от сывороток здоровых лиц (р > 0,5). Учитывая, однако, что цитотоксический эффект давали не все, а лишь часть сывороток больных с АИЗЩЖ, а также то обстоятельство, что разброс показателей в сыворотках больных значительно превышал таковой в сыворотках здоровых лиц, мы подсчитали число сывороток больных, в которых содержание pFASL существенно (т. е. больше, чем на 3 стандартных отклонения) превышало его сред­ний уровень в контроле (рис. 1).

Оказалось, что концентрация pFASL была су­щественно повышена в 9 из 24 тестированных сы­вороток больных с ДТЗ (37%), на порядок превы­шая норму в этих случаях (0,7 ± 0,3 нг/мл против 0,07 ± 0,01 нг/мл). Из 27 сывороток больных с ХЛТ уровень pFASL существенно превышал норму в 8 (30%). Среднее содержание pFASL в таких сыво­ротках составляло 0,5 ± 0,3 нг/мл. Существенная разница между частотами выявления повышенного уровня этого фактора и средними его концентра­циями при ДТЗ и ХЛТ в таких случаях отсутство­вала (р > 0,4). Важнее отметить, что частота прояв­ления комплементнезависимой цитотоксичности сывороток статистически значимо не отличалась от частоты присутствия в них повышенных концен­траций pFASL (р > 0,3). С нашей точки зрения, совпадение частот обоих показателей в разных пу­лах сывороток может свидетельствовать о важной роли взаимодействия FAS—pFASL в описанном феномене комплементнезависимой антитиреоид-

Рис. 1. Концентрация pFASL (в нг/мл) в сыворотках здоровых лиц и больных с АИЗЩЖ.

Н — здоровые лица; ХЛТ — больные ХЛТ; ДТЗ — больные ДТЗ.

ной цитотоксичности сывороток больных с АИЗЩЖ.

В литературе имеются указания на повышение уровня pFASL в сыворотках больных с нелеченой болезнью Грейвса (ДТЗ) [12]. Найденное нами по­вышение содержания этого фактора лишь в части тестированных сывороток может объясняться не­однородностью группы больных, которые, как уже отмечалось, находились на разной степени ком­пенсации тиреотоксикоза. Сведений о содержании pFASL в сыворотках больных ХЛТ нам обнаружить не удалось.

Не менее важно обратить внимание на практи­чески полное совпадение частот обнаружения ком­плементнезависимой цитотоксичности в сыворот­ках больных ХЛТ и ДТЗ (р > 0,8). Аналогичные данные были получены нами ранее в отношении АЗКОЦ [3—5], однако если цитотоксические свой­ства сывороток при ДТЗ и ХЛТ одинаковы, а мор­фологическая картина ткани щитовидной железы при этих заболеваниях принципиально различна (пролиферация тироцитов при ДТЗ и их деструк­ция при ХЛТ), то следовало предположить сущест­вование при ДТЗ механизмов защиты тиреоидной ткани от цитотоксического эффекта собственных сывороток. При исследовании АЗКОЦ нами были получены подтверждения существования таких ме­ханизмов: многие из тех сывороток, которые вызы­вали гибель "нормальных” тироцитов, оказывались неактивными в отношении клеток ДТЗ [4]. При дальнейшем анализе выяснилось, что резистент­ность этих клеток к АЗКОЦ связана с меньшим присутствием на них поверхностных антигенов, взаимодействующих с антитиреоидными аутоанти­телами [3, 6].

В связи с этим представляло несомненный ин­терес проверить действие лишенных комплемента заведомо цитотоксических сывороток на клетках, изолированных из ткани ДТЗ. Такая проверка по­казала, что из 18 предварительно лишенных ком­племента цитотоксических сывороток лишь 7 со­храняли свою активность на клетках ДТЗ (р < 0,01). Таким образом, подобно тому, что было ранее показано в отношении АЗКОЦ, тироциты из ткани ДТЗ оказались резистентными к 60% цито­токсических сывороток больных с ДТЗ.

По аналогии с тем, что наблюдалось в отноше­нии АЗКОЦ, мы предположили, что и в данном случае резистентность клеток ДТЗ связана с умень­шением на их поверхности экспрессии рецептора APOI (FAS), опосредующего апоптозиндуцирую- щий эффект pFASL, и сравнили его экспрессию на срезах щитовидных желез в "норме", при ДТЗ и ХЛТ.

Группу ДТЗ составили случаи классической диффузной микро-макрофолликулярной гипер­плазии щитовидной железы с резорбцией коллоида и очаговыми лимфоидными инфильтратами в строме. При ХЛТ брали ткань на расстоянии не ме­нее 1 см от коллоидных узлов (атрофический вари­ант с диффузно-очаговой лимфоидной инфильтра­цией стромы и формированием лимфоидных фол­ликулов со светлыми центрами). Паренхима щито­видной железы в данных случаях была представле­на в основном мелкими фолликулами с уплощен­ным (атрофичным) эпителием.

В относительно неизмененной тиреоидной тка­ни ("норма") экспрессия FAS была умеренной, т. е. он обнаруживался на мембране в среднем 32% кле­ток. При ХЛТ экспрессия маркера апоптоза была выражена в гораздо большей степени. В 17 из 20 случаев число окрашенных на FAS паренхиматоз­ных клеток превышало 60% (рис. 2, см. на вклей­ке), причем вокруг таких клеток в большом коли­честве присутствовали плазмоциты, дающие реак­цию на цепи иммуноглобулинов. Там же, где име­лись очаги пролиферации фолликулярных клеток и слабая инфильтрация плазмоцитами, экспрессия FAS была существенно слабее (окрашивались 27— 34% тироцитов). В отличие от этого в ткани ДТЗ экспрессия FAS, как правило, была очень слабой. Меньшую экспрессию FAS фолликулярными клет­ками при ДТЗ по сравнению с ХЛТ отмечали и дру­гие авторы [13]. Однако сравнение ткани ДТЗ с нормальной тиреоидной тканью, по-видимому, не проводили.

Таким образом, обнаруженная нами резистент­ность клеток ДТЗ к цитотоксическому действию лишенных комплемента и содержащих pFASL сы­вороток больных с АИЗЩЖ действительно может быть следствием меньшей экспрессии FAS такими клетками.

Что касается ядерного маркера пролиферации Ki-67, то, как и следовало ожидать, он выявлялся в клетках при ХЛТ реже (в среднем в 20% тироци­тов), а при ДТЗ — гораздо чаще (81%), чем в клет­ках "нормальной" ткани щитовидной железы (27%).

В клетках обнаружена мРНК FAS, кодирующая растворимую форму этого антигена — pFAS, не со­держащую трансмембранного домена. Предполага­ется, что pFAS, "отвлекая на себя" соответствую-

Уровни pFAS в сыворотках больных с АИЗЩЖ (М ± т)

Примечание, р, — значимость различий между здоро­выми лицами и больными с ДТЗ; р₂ — между здоровыми лицами и больными ХЛТ; р_} — между больными с ДТЗ и ХЛТ.

щий лиганд, защищает клетки-мишени от апопто- зиндуцирующего действия последнего [10]. Ряд ав­торов обнаружили повышенное содержание pFAS в сыворотках больных с нелеченой болезнью Грейв­са; антитиреоидная терапия приводила к сниже­нию его уровня. При гипотиреозе на фоне ХЛТ уровень pFAS был снижен [12]. В свете этих данных представляло интерес оценить концентрацию pFAS в исследуемых нами сыворотках. Полученные дан­ные приведены в таблице.

Нам не удалось обнаружить сколько-нибудь значимых различий в уровне pFAS между сыворот­ками больных и здоровых лиц. Ни в одном случае его содержание при ДТЗ или ХЛТ не выходило за пределы 3 стандартных отклонений от средней его концентрации в норме. Даже если допустить при ДТЗ повышение уровня pFAS в сыворотках, этим невозможно объяснить выявленную нами "защи­щенность" тироцитов из ткани ДТЗ от цитотокси­ческого действия соответствующих сывороток. Действительно, как показано выше, причина рези­стентности таких клеток кроется отнюдь не в сы­воротках (иначе они должны были бы вызывать ги­бель "нормальных" тиреоидных клеток с той же частотой, что и клеток из ДТЗ), а в самих гипер­плазированных клетках щитовидной железы.

Согласно данным С. Giordano и соавт. [11], экс­прессия FAS тироцитами стимулируется продукта­ми определенных субпопуляций активированных Т-лимфоцитов, "населяющих" щитовидную железу при ее аутоиммунных заболеваниях. Найденное нами снижение экспрессии FAS фолликулярным эпителием при ДТЗ может указывать на различие популяций инфильтрирующих щитовидную железу лимфоцитов при ДТЗ и ХЛТ [4]. Действительно, как было показано ранее в опытах in vitro [5], лим­фоциты из ткани ДТЗ не только не индуцируют ги­бель "нормальных" тироцитов, но, напротив, спо­собствуют их пролиферации и снижают их способ­ность связывать антитиреоидные антитела.

В заключение необходимо подчеркнуть, что предположение о зависимости цитотоксического эффекта сывороток больных с АИЗЩЖ от повы­шенного содержания в них pFASL оставляет от­крытым вопрос о существовании и характере меха­низмов, определяющих специфичность действия pFASL в отношении тироцитов.

Выводы

1. Почти в 40% сывороток больных с ДТЗ и ХЛТ (находящихся на разных этапах медикаментозного лечения) присутствуют независимые от компле­мента факторы, индуцирующие in vitro гибель "нормальных" (изолированных от околоузловой ткани эутиреоидного узлового зоба) тироцитов.
2. Цитотоксический эффект сывороток больных с АИЗЩЖ не проявляется на первичной культуре фибробластов, что свидетельствует о его специ­фичности в отношении тироцитов.
3. Частота обнаружения повышенных уровней pFASL в сыворотках больных с АИЗЩЖ совпадает с частотой выявления комплементнезависимой ци­тотоксичности аналогичных сывороток.

Тироциты, изолированные из ткани ДТЗ, ре­зистентны к действию 60% из тех сывороток, кото­рые оказывают цитотоксическое действие на "нор­мальные" тироциты. Эта резистентность связана не с повышением уровня pFAS в соответствующих сыворотках, а с ослабленной экспрессией FAS на мембране клеток.