Влияние адреналина и кортикостерона на захват и распределение атерогенных и антиатерогенных липопротеинов в миокарде

Роль липопротеинов (ЛП) в развитии сердечно­сосудистой патологии в литературе обсуждается в разных аспектах: в связи с влиянием гормонов стресса и активацией лизосомального аппарата клеток [6], с развитием аутоиммунных процессов [1], нарушением обмена насыщенных и ненасы­щенных жирных кислот [10] и др. Однако влияние катехоламинов, глюкокортикоидов и ЛП крови (атерогенных и антиатерогенных) непосредственно на миокард в литературе практически не раскрыто. Это особенно справедливо по отношению к ЛП, которые являются важнейшим поставщиком жир­ных кислот как энергетического материала во мно­гие ткани, в том числе в сердце. В условиях стресса регуляторное влияние катехоламинов и глюкокор­тикоидов на энергетику миокарда дополняется ре­гуляторными свойствами отдельных аполипопро­теинов (апо-ЛП). Например, апоСП повышает ак­тивность липопротеинлипазы [14], anoAI — актив­ность ЛХАТ [15]. Можно говорить и о других регу­ляторных свойствах апо-ЛП. Нами впервые было показано, что anoAI присутствует также в ядрах многих клеток, в том числе в сердце [7]. Оказалось, что в комплексе с восстановленными формами сте-

' Работа выполнена при поддержке Регионального общест­венного фонда содействия отечественной медицине. роидных гормонов (тетрагидросоединениями) они участвуют в регуляции экспрессии генов [7, 8].

В данной работе мы попытались оценить влия­ние адреналина, кортикостерона, ЛП высокой (ЛПВП) и низкой (ЛПНП) плотности на миокард в модели перфузируемого сокращающегося сердца крыс, а также показать роль гормонов в захвате и межклеточном распределении атерогенных и анти­атерогенных ЛП.

Материалы и методы

В опытах с перфузией сердца по Лангендорфу использовали крыс линии Вистар массой около 300 г. Перфузатом служил буферный раствор Кребса— Хензеляйта [3]. В перфузионный раствор добавля­ли меченные коллоидным золотом сывороточные ЛПНП (1,006-1,063 г/мл, 15-20 мг%) или ЛПВП (1,063—1,21 г/мл, 200—250 мг%) (6 опытов). В дру­гих сериях в перфузат добавляли ЛП совместно с адреналином в концентрации 1 мг/л (6 опытов) или кортикостероном 2 мг/л (8 опытов). Контролем служили 5 опытов с перфузией сердца раствором Кребса—Хензеляйта и 7 опытов с добавлением гор­монов без ЛП.

Скорость гликогенолиза в сердце определяли у крыс линии Вистар массой 180—200 г. Животных забивали под легким эфирным наркозом, сердце извлекали и отмывали от крови в охлажденном трис-НС1-буфере pH 7,4. После гомогенизации и центрифугирования при 50 000 g в течение 30 мин получали надосадок, в котором гликогенолиз изу­чали в реконструированной системе, содержащей все необходимые для этого кофакторы и субстраты. Состав среды инкубации: 20 мМ трис-НС1-буфера pH 7,4, 7 мМ фосфатного буфера pH 7,4, 5 мМ MgCl₂, 0,2 мМ НАД, 1 мМ АТФ, 5 мМ никотина­мида, 2 мМ цистеина и 0,1% раствор гликогена. Содержание лактата определяли по НАДФ при длине волны 340 нм и выражали в наномолях в ми­нуту на 1 мг белка.

Для электронно-микроскопического исследова­ния миокард левого желудочка после 30 мин пер­фузии фиксировали в 2,5% растворе глутаральдеги­да и 2% растворе параформальдегида, дофиксиро- вали в 1,5% растворе OsO₄, заливали в смесь эпона с аралдитом. Ультратонкие срезы контрастировали уранил-ацетатом и цитратом свинца, просматрива­ли в электронном микроскопе JEM 100SX при уве­личении от 5 до 20 тыс. раз. Оценивали распреде­ление метки (в процентах от общего количества), подсчитывая гранулы золота в эндотелиоцитах, макрофагах и интерстициальном пространстве на площади среза 0,01 мкм². Определяли распределе­ние метки в инвагинациях, эндосомах, лизосомах и свободно в цитоплазме эндотелиоцитов (в процен­тах от количества гранул в эндотелии). Проводили качественный анализ структур кардиомиоцитов и интерстициальных макрофагов.

Статистическую обработку данных проводили в пакете Statgraphics 4.0. Различия оценивали с по­мощью непараметрического критерия Манна- Уитни при 5% уровне значимости.

Результаты и их обсуждение

В проведенных экспериментах в режиме рецир­куляции раствором Кребса—Хензеляйта сердце могло работать достаточно стабильно, поддержи­вая частоту и амплитуду сокращений, а также ве­личину коронарного потока постоянными не менее 2 ч.

Влияние адреналина и кортикостерона на биохимические и структурные характеристики миокарда

Добавление в перфузионную среду адреналина вызывало увеличение коронарного потока, ампли­туды и частоты сокращений в среднем в 1,5 раза. Морфологически при этом микроциркуляторное русло было расширено, а в кардиомиоцитах выяв­лены пересокращения миофибрилл, расширения каналов саркоплазматической сети и плотные осадки в митохондриях, что соответствует ультра- структурным признакам легкой кальциевой пере­грузки по В. Г. Шарову [11]. В цитоплазме некото­рых кардиомиоцитов на месте гликогена распола­галась пылевидная зернистость.

Известно, что увеличение сократительной ак­тивности миокарда под влиянием адреналина свя­зано не только с повышением коронарного крово­тока и обеспечением сердца кислородом, но и с ак­тивацией гликогенолиза. Возможно, последний механизм является определяющим. Он связан с возрастанием концентрации цАМФ в ткани и ак­тивности фосфорилазы под влиянием адреналина [19]. Оказалось, что цАМФ в концентрации 10"⁴— 10"³ М значительно повышал скорость гликогено­лиза как в сердце, так и в мышцах (табл. 1). Этот процесс был выражен в еще большей степени под влиянием АМФ — специфического активатора фосфорилазы В. Полученные биохимические ре­зультаты хорошо согласуются с картинами распада гликогена в кардиомиоцитах под влиянием адрена­лина, выявленного с помощью электронной мик­роскопии.

Добавление кортикостерона в перфузат не ока­зывало существенного влияния на сердечную дея­тельность, не уменьшало перфузионные измене­ния в миокарде, выявленные в контрольных опы­тах с раствором Кребса—Хензеляйта [2], что под­тверждает отсутствие прямого влияния кортико­стероидов на работу сердца [4]. Однако при этом снижалось содержание гликогена в мышечных клетках сердца, наблюдались его секвестрация в саркоплазме и выделение остатков в интерстиций. Механизм повышенного распада гликогена под влиянием кортикостерона аналогичен вышеопи­санному. Он связан с возможностью действия гор­мона через [3-адренорецепторы как в случае с адре­налином [6], т. е. с повышением активности фос­форилазы под влиянием цАМФ.

Влияние ЛПВП и ЛПНП на ультраструктуру миокарда

Добавление в перфузат нативных ЛПНП не от­ражалось на сократительной способности миокар­да, а ЛПВП в тех же условиях увеличивали частоту и амплитуду сокращений. Повышение работоспо­собности сердца под влиянием ЛПВП мы связыва­ем с активацией гликолиза. Ранее нами было по­казано, что под влиянием ЛПВП происходит по­вышение скорости гликолиза в печени [5], однако механизм этого явления остался нераскрытым. Электронно-микроскопические исследования по­казали, что за 30 мин меченые ЛП обоих классов взаимодействовали с эндотелиоцитами (табл. 2). Более активно рецепторопосредованным путем за­хватывались ЛПВП и располагались в опушенных пузырьках, не покидая стенки капилляров. ЛПНП проникали в интерстиций быстрее и накаплива­лись в лизосомах активированных макрофагов

Таблица 1

Влияние цАМФ в различных концентрациях и АМФ на гликоге­нолиз в сердечной и скелетной мышцах крыс

Сердце            61 ± 8,6         74 ± 10,0* 73 ± 9,7*               94 ± 8,0*

Мышца           93 ± 10,4       113 ± 15,0* 121 ± 13,7* 163 ± 18,0*

При ме ча ние. Скорость гликогенолиза дана в наномо­лях лактата в минуту на 1 мг белка (М ± т). В каждой группе было по 7 животных. * — статистически значимые различия с контролем при р < 0,05.

Таблица 2

Число (М, min—max) и распределение метки внутри эндотели­альных клеток (в %) при перфузии изолированного сердца крыс мечеными ЛП и гормонами

Примечание. Ад — адреналин, Кс — кортикостерон.

Влияние адреналина и кортикостерона на связывание и распределение ЛП в миокарде

Совместное добавление адреналина и меченых ЛПВП в перфузат не влияло на проникновение и распределение последних в миокарде. Метки на срезах было достаточно много, но она, как и в опы­тах без адреналина, не выявлялась за пределами со­судистого русла (см. рис. 1). При этом почти 3/4 метки находилось на люминарной поверхности эн- дотелиоцитов и в опушенных инвагинациях, ос­тальная часть — в опушенных пузырьках (см. табл. 2). В этих опытах эндотелиоциты и макрофаги приоб­ретали ультраструктурные признаки активного функционирования. Кардиомиоциты содержали активированные ядра с минимальным количеством гетерохроматина, многочисленными порами в обо­лочке и очень крупными ядрышками нуклеонем- ного строения. В саркоплазме встречались умерен­ные обратимые повреждения, характерные для функционального перенапряжения органоидов. Известно, что ЛПВП являются активным участни­ком липолитических процессов, обеспечивающих ткани свободными жирными кислотами [10].

При совместном добавлении адреналина и ЛПНП количество метки, связанной с эндотелием, возрастало в 3 раза, а ее распределение свидетель­ствовало о более медленном проникновении в тка­ни по сравнению с ЛПНП без адреналина (см. рис. 1, табл. 2). Абсолютное большинство метки (см. табл. 2) располагалось в контакте с люминарной поверхностью эндотелиоцитов (прилипание и ин­вагинации). За 30 мин перфузии с адреналином в макрофаги проникало только 11% метки, при этом она концентрировалась исключительно в эндосо­мах (рис. 2, см. на вклейке), в то время как без ад­реналина метки в макрофагах фиксировалось в 4 раза больше (см. рис. 1), и почти половина ее рас­полагалась уже в лизосомах. В этих опытах были выявлены некоторые особенности проникновения в миокард меченых ЛПНП, которые не поглоща­лись целиком, а претерпевали частичное разруше­ние (лизис) на поверхности эндотелиоцитов. Это хорошо согласуется с данными о том, что липопро- теинлипаза способна связываться с мембранами эндотелиальных клеток через глюкозаминоглика- ны и одновременно взаимодействовать с ЛП [1]. В этом случае количество фермента определяет число ЛП частиц, которое он удерживает на поверхности клеток [13]. Таким образом, регулируется поступ­ление главного энергетического материала — жир­ных кислот в миокард. Есть данные о том, что кар- диотоксическое действие катехоламинов обуслов­лено увеличением образования свободных радика­лов [17]. Способность ЛП связывать свободные ра­дикалы может лежать в основе их кардиопротек- торного эффекта [12, 16].

При совместной перфузии сердца кортикосте­роном и ЛП обоих классов отмечены уменьшение содержания гликогена в клетках, секвестрация его внутри кардиомиоцитов, отделение участков цито­плазмы с остатками гликогена (клазматоз) в интер­стиций и капиллярное русло. Данный эффект, ве­роятно, связан с относительным избытком гормона по отношению к ЛП.

Добавление кортикостерона вызывало увеличе­ние числа связанной с эндотелием метки почти в 5 раз по сравнению со всеми другими опытами с ЛПВП (см. рис. 1). Резкое усиление рецепторопос- редованного эндоцитоза (рис. 3, см. на вклейке) в эндотелии проявлялось в том, что метка накапли­валась преимущественно в опушенных пузырьках (см. табл. 2). К концу эксперимента много метки располагалось около базальной поверхности эндо­телия, где зафиксированы многочисленные карти­ны открытия эндосом. Иногда скопления гранул располагались вблизи расширенных межклеточных контактов, что не исключало их выход, минуя эн­дотелиоциты. Принципиальное отличие опытов с кортикостероном и ЛПВП заключалось в том, что метка была обнаружена в интерстиции и макрофа­гах, хотя и в небольшом количестве (см. рис. 1). Неожиданной находкой явилось обнаружение ме-

Ад — адреналин, Кс — кортикостерон.

По оси ординат — число метки в 0,01 мм².

а - ЛПНП; б - Ад + ЛПНП; в - Кс + ЛПНП; г - ЛПВП; д - Ад + ЛПВП; е - Кс + ЛПВП. ченых комплексов не только в эндотелии и интер- стиции, но и в просветах лимфатических сосудов, которые располагались в тесном сплетении с кро­веносными капиллярами (в подсчетах эту метку не учитывали).

Известно, что ЛПВП связывают и переносят широкий набор глюкокортикоидов [9]. В данном случае коллоидным золотом визуализируется сложный комплекс ЛП с кортикостероном. Можно предположить, что этот комплекс поглощается значительно активнее, чем просто ЛПВП. Возмож­но, в сердце, как и в печени, срабатывает коопера­тивный эффект ЛПВП и глюкокортикоидов, на­правленный на активацию генома и усиление био­синтеза белка в клетках [2, 18]. Это свидетельствует о том, что ЛП крови могут не только принимать участие в транспорте различных лигандов (гормо­нов), но вместе с ними оказывать регуляторное влияние на геном клеток.

При совместном введении ЛПНП и кортикосте­рона убедительно показано их стимулирующее влияние на функциональные показатели сердца. Большая часть кардиомиоцитов находилась в со­стоянии мягкого пересокращения, лишь некото­рые из них имели признаки умеренного миоцито­лизиса. Просветы большинства капилляров были расширены, иногда очень сильно. Метки, связан­ной с эндотелием (см. рис. 1), было очень мало (13 на 0,01 мм²), в основном она находилась в связи с ЛП на люминарной поверхности и в инвагинациях, и лишь единичные гранулы располагались в опу­шенных пузырьках (см. табл. 2). Это можно объяс­нить активно протекающим процессом липолиза на поверхности эндотелия, обеспечивающим мио­кард свободными жирными кислотами.

Выводы

1. Адреналин усиливает растворение меченных коллоидным золотом ЛПНП на поверхности эндо­телия, общее число связанной метки возрастает, а ее распределение свидетельствует о более медлен­ном проникновении в миокард по сравнению с перфузией сердца ЛПНП без адреналина. При до­бавлении в перфузат адреналина вместе с ЛПВП не отмечено изменений в проникновении и распреде­лении метки, которая не покидает стенки капилля­ров.
2. Совместная перфузия сердца ЛПНП с адре­налином предохраняет структуру кардиомиоцитов от повреждающего действия адреналина, полно­стью снимая признаки кальциевой перегрузки.
3. Кортикостерон во всех опытах вызывал сни­жение содержания гликогена в мышечных клетках сердца, секвестрацию в саркоплазме его остатков и выделение их в интерстиций.
4. Добавление в перфузат ЛПВП совместно с кортикостероном в 5 раз усиливало их рецепторо- посредованное поглощение эндотелием капилля­ров и обеспечивало их проникновение в интерсти­циальные макрофаги. Кортикостерон затруднял проникновение меченых ЛПНП в миокард при их совместном добавлении в перфузат по сравнению с аналогичными опытами без гормона.

Адреналин и кортикостерон по-разному влия­ют на проникновение и распределение в миокарде ЛПНП и ЛПВП. В условиях стресса это обеспечи­вает мобилизацию разных метаболических путей для энергообеспечения миокарда.