Preview

Проблемы Эндокринологии

Расширенный поиск

Состояние NPY-синтезирующих клеток островков Лангерганса у нормальных и диабетических крыс при введении синтетического нейропептида Y

https://doi.org/10.14341/probl11530

Полный текст:

Аннотация

Целью исследования явились идентификация и изучение со стояния NPY-синтезирующих клеток островков Лангерганса у крыс линии Вистар в норме, при стрептозотоциновом сахарном диабете различного срока, а также при хроническом введении синтетического NPY животным с диабетом. NPY- и инсулинсинтезирующие клетки в островках идентифицировали методом непрямой иммунофлюоресценции наборами фирмы "Peninsula Laboratories Inc." (США) и анализировали их состояние с помощью компьютерной системы анализа изображения V1DAS-386 ("Kontron Elektronik", Германия). NPY-иммунореактивные клетки выявлялись в островках у нормальных животных и имели разнообразную форму и размеры. Развитие сахарного диабета к концу 3-й недели приводило к увеличению их количества по сравнению с контролем более чем в 2 раза, что указывало на активацию синтеза пептида, в то время как к 35-му дню заболевания оно возвращалось к норме. Введение животным синтетического пептида с 26-го по 35-й день развития диабета в значи тельной степени восстанавливало количество и функцию /3-клеток и в то же время предотвращало торможение синтеза NPY в островках, стимулировало его секрецию.

Для цитирования:


Траилин А.В., Колесник Ю.М., Орловский М.А. Состояние NPY-синтезирующих клеток островков Лангерганса у нормальных и диабетических крыс при введении синтетического нейропептида Y. Проблемы Эндокринологии. 2001;47(3):36-41. https://doi.org/10.14341/probl11530

For citation:


Trailin A.V., Kolesnik Yu.M., Orlovsky M.A. NPY-Synthesizing cells of Langerhans’ islets in normal and diabetic rats after injection of synthetic neuropeptide Y. Problems of Endocrinology. 2001;47(3):36-41. (In Russ.) https://doi.org/10.14341/probl11530

Известно, что нейропептид Y (NPY), широко представленный в ядрах гипоталамуса [9], играет важную роль в центральной регуляции метаболи ческих процессов в норме и при патологии, в ча стности при сахарном диабете [13]. Наши преды дущие исследования показали важную роль NPY в регуляции функции р-клеток в норме и при экспе риментальном диабете, что проявлялось торможе нием деструкции р-клеток, стимуляцией синтеза и секреции инсулина [4]. В последние годы была ус тановлена способность эндокринных клеток ост ровков Лангерганса эмбрионов [20, 24] и половоз релых особей синтезировать NPY [8, 18, 21, 22]. В связи с этим было выдвинуто предположение о его важной роли в паракринной регуляции синтеза и секреции инсулина [8, 21, 30], которое получило дальнейшее подтверждение при идентификации Y1 -рецепторов NPY на мембране р-клеток [19]. Вместе с тем до сих пор состояние NPY-синтези рующих клеток островков Лангерганса у животных с диабетом практически не изучалось, а вопрос о возможности синтеза самого пептида в островках половозрелых здоровых особей является предме том исследования [18, 23]. В связи с этим целью на шей работы являлось изучение состояния NPY- синтезирующих клеток в островках Лангерганса у нормальных и диабетических крыс и при хрониче ском введении синтетического NPY животным с диабетом. Материалы и методы Исследование проведено на 70 крысах линии Вистар в возрасте 4-6 мес массой 250-270 г. Экс периментальные животные были разделены на 4 группы: 1-я - контрольные крысы; 2-я - крысы с диабетом длительностью 3-5 нед; 3-я и 4-я - кры сы с диабетом длительностью 5 нед, которым с 26-го дня вводили NPY интраперитонеально или интрацеребровентрикулярно. Использовали стреп- тозотоциновую модель сахарного диабета [4, 28]. Синтетический NPY ("Peninsula Laboratories Inc.", США) вводили с 26-го по 35-й день течения диа бета: интрацеребровентрикулярно в дозе 10 нг и интраперитонеально в дозе 2,5 мкг по ранее опи санной методике [4]. На протяжении всего экспе римента у животных систематически контролиро вали уровень гликемии. Через 24 ч после послед него введения пептида на фоне 16-часового голо дания животных декапитировали, извлекали под желудочную железу и подвергали ее гистологиче ской обработке. Идентификацию инсулин- и NPY- иммунореактивных клеток в срезах поджелудочной железы толщиной 5 мкм проводили методом не прямой иммунофлюоресценции с использованием наборов фирмы "Peninsula Laboratories Inc." (США). Для оценки состояния клеток использова ли компьютерную систему цифрового анализа изо бражения VIDAS-386 [4]. На срезах, обработанных антисывороткой к NPY, в автоматическом режиме по специальной программе VIDAS-2.5 ("Kontron Elektronik", Германия) определяли количество пеп- тидсинтезирующих клеток в плоскости среза, при дальнейшем изложении именуемое как количество клеток в островке, их площадь (в мкм2), а также площадь (в мкм2), концентрацию и содержание в клетках иммунореактивного материала (в условных микроединицах - мкЕ). Эти же параметры опре деляли при изучении срезов, обработанных анти сывороткой к инсулину. Определение концентра ции инсулина в крови проводили по общеприня тым ранее описанным методикам [4]. Результаты исследования обрабатывали статистически при по мощи программы Ехсе1-7 с использованием Г-кри- терия Стьюдента. Результаты и их обсуждение У нормальных животных в островках в среднем идентифицировалось 7 NPY-иммунореактивных клеток, которые имели разнообразную форму и размеры (рис. 1). В большинстве островков клетки локализованы в периферической зоне по всему пе риметру. Наиболее часто встречались округлые, полигональные, а также нейроноподобные клетки. По-видимому, последние представляют собой ис тинные нейроны (рис. 2), наличие которых в ост ровках Лангерганса является установленным фак том [2], а последние работы [27] о выявлении в них NPY подтверждают наше предположение. Таким образом, наши данные подтверждают мнение [8, 18] о том, что синтез NPY в островках возможен не только у эмбрионов [20, 24], но и у интактных половозрелых грызунов. Предполагается, что источ ником синтеза NPY в островках могут также быть 0-, а-, А- и панкреатические полипептидсинтези- рующие клетки [18, 22, 31]. С помощью алгоритма классификации Bayes classifier из программного пакета VIDAS-2.5 ("Kon tron Elektronik", Германия) нами было установлено, что NPY-иммунореактивные клетки островков представляли собой 2 отдельных класса, достовер но различающихся по всем регистрируемым пара метрам. Клетки 1-го класса отличались более низ кой концентрацией и содержанием иммунореак тивного материала, а также относительно большей площадью клеток и площадью в них иммунореак тивного материала. Соотношение клеток 1-го и 2-го класса составляло 43 и 57% соответственно. Выявленные нами различия параметров NPY-им- мунореактивньгх клеток с учетом данных литерату ры [11], по-видимому, отражают различные фазы секреторного цикла эндокринных клеток: постсек реторную для клеток 1-го класса и фазу активного синтеза и накопления пептида для 2-го класса. Развитие сахарного диабета к концу 3-й недели приводило к уменьшению количества 0-клеток в островках более чем в 2 раза. При этом отмечали увеличение площади клеток и площади в них им мунореактивного материала. Концентрация инсу лина в клетках уменьшалась, а его содержание дос товерно увеличивалось по отношению к контролю (см. таблицу). Эти изменения сопровождались уве личением уровня гликемии до 8,69 ± 0,44 ммоль/л (в контроле 3,71 ± 0,15 ммоль/л) и свидетельство вали о деструкции 0-клеток и компенсаторном уси лении синтеза и секреции инсулина сохранивши мися клетками. В этот же период среднее количество идентифи цированных NPY-иммунореактивных клеток в ост ровках увеличивалось по сравнению с контролем более чем в 2 раза (см. таблицу), встречались даже отдельные островки, содержащие более 30 имму нореактивных клеток (рис. 3). Отмечалось досто верное увеличение площади клеток, площади им мунореактивного материала, концентрации и со держания в них пептида. При этом значительно (до 13%) уменьшалась доля клеток 1-го класса, а доля клеток 2-го класса, напротив, существенно возрас тала. Выявленные изменения свидетельствовали об активации синтеза пептида, что, возможно, было связано с ослаблением тормозного влияния инсу лина на NPY-синтезируюшие клетки островков [22]. Кроме того, увеличение количества идентифи цированных NPY-иммунорективных клеток могло быть связано с тем, что в процесс его синтеза до полнительно вовлекалось большое количество А- и а-клеток [21, 31], которые не подвергаются дест рукции и обладают способностью синтезировать данный пептид. Необходимо также учитывать воз можность пролиферации и дифференцировки эпи телия выводных протоков поджелудочной железы, что, по данным [25], может быть дополнительным источником cc-клеток у диабетических животных. Кроме того, в наших предыдущих исследованиях Состояние р- и NPY-иммунорсактивных (NPY-ИР) клеток островков Лангерганса у крыс в норме и при экспериментальных воздей ствиях (М ± т) Группа животных Число клеток Площадь иммунореактив ного материала в клетках, мкм2 Площадь клеток, мкм2 Концентрация иммунореак тивного материала в клетках, мкЕ Содержание иммуноре активного материала в клетках, мкЕ 13- клетки NPY- ИР- клетки р-клетки NPY-ИР- клетки р-клетки NPY-ИР- клетки Р-клетки NPY-ИР- клетки р-клетки NPY-ИР- клетки Интактные 3212 710 95,510,4 52,410,5 109,810,7 65,410,8 4,3410,02 3,9910,03 2442+15 1137115 Диабетические (3 нед) 1511“ 1612“ 112,411,4“ 69,610,7“ 131,211,4“ 80,610,8“ 3,6910,03“ 4,8910,03“ 2549+40“ 1991126“ Диабетические (5 нед) 7±0аЬ 510аЬ 132,1±1,баЬ 58,6±0,8ь 148,911,5"*’ 70,2+0,9Ь 3,5810,04“ь 3,78+0,03“ь 2894±52“ь 1198118“ь Диабетические и интраперито неальным вве дением NPY 2713Ьс 10+1“ 90,510,5abcd 50,010,7“ 107,3i0.6abtd 63.2+0,8“ 3,8810,0Г1Ь“1 3,2710,03“ 2094116abcd 920+14аЬс Диабетические с интрацеребро вентрикуляр ным NPY 2512“Ьс 8±lcd 98,710,6',Ьс“ 41,5±0,73cd 114,2+0,6““ 53,0±0,9“d 3,93+0,01““ 2,64+0,03““ 2296117“bcd 60011 lobcd Примечание, а - достоверность (р < 0,05) различий с контролем; b - с 3-недельным диабетом; с - с 5-недельным диабетом; d - между интраперитонеальным и интрацеребровентрикулярным введением показано увеличение синтеза гормонов А- и а-клетками при диабете с увеличением их количе ства в островках [3, 4]. Синтез NPY может также активироваться в сохранившихся, интенсивно функционирующих р-клетках [22] или во вновь об разованных р-клетках [33], которые регенерируют посредством дифференцировки ациноостровковых (переходных) клеток [12, 14]. В последних NPY мо жет выступать в качестве аутокринного стимулято ра созревания, что показано в работах [20, 24]. Кро ме того, определенный интерес вызывает установ ленная способность активированных макрофагов экспрессировать NPY [29]. В островках у экспери ментальных животных нами были идентифициро ваны единичные макрофаги, активация которых играет важную роль в инициации деструкции Р-клеток при диабете типа 1 [6]. К 35-му дню отмечали дальнейшее (р < 0,001) уменьшение количества р-клеток, увеличение пло щади клеток, площади иммунореактивного мате риала и содержания в них пептида, а также сниже ние концентрации инсулина в клетках по сравне нию с контролем (см. таблицу). Эти изменения указывали на прогрессирование процесса деструк ции р-клеток, что подтверждалось достоверным (р < 0,001) увеличением уровня гликемии, который составлял 18,90 ± 0,95 ммоль/л. Вместе с тем изме нение параметров р-клеток указывало на еще боль шее усиление синтеза и секреции в них инсулина. Количество NPY-иммунореактивных клеток в островках (рис. 4) и соотношение клеток 1-го и 2-го классов становилось таким же, как у кон трольных животных (см. таблицу). При этом пло щадь клеток, площадь иммунореактивного мате риала и содержание в них пептида достоверно уменьшались (р < 0,001), однако уровня контроля не достигали. Концентрация в клетках пептида снижалась по сравнению не только с 3-недельным диабетом (р < 0,001), но и с контролем (см. табли цу). Выявленные изменения, по нашему мнению, свидетельствовали о торможении синтеза пептида в островках. Последнее, возможно, было связано с деструкцией значительного количества р-клеток, часть из которых ранее синтезировала NPY [20, 22, 24, 33]. Вместе с тем увеличение процента клеток 1- го класса свидетельствовало об активации процесса секреции NPY, в котором, по-видимому, принима ли участие сохранившиеся р-клетки, а также а- и А-клетки [3, 22]. Оба способа введения NPY с 26-го по 35-й день течения диабета не только предотвращали дальней шее снижение количества р-клеток у диабетиче ских животных к концу 5-й недели, но и приводили к его достоверному увеличению по сравнению с 3-недельным диабетом (/? < 0,001). При этом отме чалась нормализация большинства параметров, ха рактеризующих состояние р-клеток (см. таблицу). В крови увеличивалась концентрация инсулина до 44,5 ± 4,9 и 47,7 ± 2,9 мг/мл при интраперитоне альном и интрацеребровентрикулярном введении пептида соответственно (у нормальных животных концентрация инсулина в крови составляла 62,1 ± 5,8 мг/мл, а у крыс с 5-недельным диабе том - 18,0 ± 3,2 мг/мл). Уровень гликемии значи тельно снижался (6,33 ± 0,62 и 6,00 ± 0,53 ммоль/л при интраперитонеальном и интрацеребровентри кулярном введении пептида соответственно). Приведенные данные показывают, что введение NPY не только уменьшало степень деструкции р-клеток, но и, по-видимому, стимулировало их регенерацию [20, 24, 33]. Кроме того, оба способа введения пептида усиливали синтез и секрецию инсулина, более выраженные при интрацеребро вентрикулярном введении, что, видимо, было обу словлено активацией центральных механизмов ре гуляции функции р-клеток [4]. Полученные нами данные позволяют предполо жить, что введение NPY оказывает влияние на от дельные звенья процесса аутоиммунной деструк ции р-клеток. Это может быть обусловлено способ ностью пептида вызывать торможение хемотаксиса макрофагов [10], которые являются основным источником ИЛ-1 [6] и TNF [5], а также уменьшать секрецию Т-хелперами 1-го типа [17] IFN-y [7, 15]. Указанные аспекты действия NPY весьма актуаль ны, поскольку ИЛ-1, TNF и IFN-y [6, 15] играют ключевую роль в деструкции р-клеток при диабете типа 1. Количество NPY-иммунореактивных клеток в островках у диабетических крыс возрастало до уровня контроля при интрацеребровентрикуляр- ном способе введения пептида, а при интрапери тонеальном - увеличивалось даже по отношению к контролю (см. таблицу). Процент клеток 1-го клас са значительно возрастал, причем в большей сте пени - при интрацеребровентрикулярном способе введения (82 и 54% соответственно). Площадь кле ток, площадь иммунореактивного материала, кон центрация и содержание в них пептида уменьша лись по сравнению со значениями этих параметров не только у диабетических (р < 0,001), но и у кон трольных животных. Описанные изменения были выражены в большей степени при интрацеребро вентрикулярном введении пептида (р < 0,001). Хроническое интрацеребровентрикулярное и интраперитонеальное введение физиологического раствора диабетическим крысам не влияло на изу чаемые нами показатели (р > 0,05). Таким образом, нами показано, что синтез NPY в островках Лангерганса у диабетических живот ных усиливается на 3-й неделе заболевания, а к концу 5-й недели возвращается к контрольному уровню. Введение синтетического пептида диабе тическим животным (в большей степени - цен тральное) предотвращало торможение синтеза пеп тида, стимулировало его секрецию и при этом в значительной степени восстанавливало количество и функцию р-клеток. По-видимому, активация NPY-ергической сис темы островков является одним из механизмов ком пенсации сахарного диабета, который включается к концу 3-й недели заболевания и истощается по мере прогрессирования патологического процесса. Экзо генное введение NPY нормализует эти нарушения и способствует торможению деструкции р-клеток [7, 10, 17], ускорению их регенерации [20, 24, 29], уве личению синтеза и секреции инсулина и восстанов лению нарушенных при развитии диабета паракрин ных взаимоотношений в островках. Что же касается установленного нами [4] и рядом других авторов тормозного паракринного эффекта NPY на секрецию инсулина у нормальных живот ных [8, 29], то, возможно, характер его влияний в ус ловиях патологии при развитии диабета может из меняться, что ранее показано нами для других изу ченных пептидов, в частности для ХЦК [1]. Следует также учитывать, что действие NPY не ограничивается его аутокринным и паракринным влиянием на [3-клетки. В частности, показано, что системное введение NPY усиливает инсулининду- цированную утилизацию глюкозы мышечной [32] тканью и, таким образом, может способствовать снижению уровня гликемии. Выводы 1. Островки Лангерганса половозрелых интакт ных крыс содержат NPY-иммунореактивные клет ки, которые характеризуются морфофункциональ ным полиморфизмом. 2. Активность NPY-ергической системы остров ков Лангерганса увеличивается к 25-му дню разви тия диабета, а к 35-му дню снижается. 3. Введение NPY животным с сахарным диабе том способствует торможению деструкции [3-кле ток, усилению синтеза и секреции инсулина, что свидетельствует об участии NPY-ергической систе мы островков в механизмах компенсации сахарно го диабета.

Список литературы

1. Абрамов А. В. Вестник проблем биологии и медицины. - Т. 25. - С. 94-99.

2. Баранов В. Г. Физиология эндокринной системы. - Л., 1979. - С. 574-580.

3. Колесник Ю. М., Василенко Г. В., Абрамов А. В. // Арх. пат. - 1992. - Т. 54, № 12. - С. 24-27.

4. Колесник Ю. М., Абрамов А. В., Траилин А. В., Тржецинский С. Д. // Пробл. эндокринол. - 1999. - Т. 45, № 2. - С. 42-45.

5. Соколов Е. И. Клиническая иммунология. - М., 1998. - С. 39.

6. Arnush М., Scarim A. L., Heitmeier М. R. et al. // J. Immunol. - 1998. - Vol. 160, N 3. - P. 2691-2694.

7. Balasa B., Krahl T., Patstone G. et al. // Ibid. - 1997. - Vol. 159, N 9. - P. 4629.

8. Bennet W. M., Wang Z. L., Jones P. M. et al. // J. Clin. Endo crinol. Metab. - 1996. - Vol. 81. - P. 2117-2120.

9. Chronwall В. M., DiMagio D. A., Massari V. J. et al. // Neuroscience. - 1985. - Vol. 15. - P. 1159-1181.

10. Dureus P., Louis D., Grant A. V. et al. // Cell. Mol. Neurobiol. - 1993. - Vol. 13, N 5. - P. 541-546.

11. Felig P., Baxter J. D., Frohman L. A. Endocrinology and Metabolism. - New York, 1995. - P. 69-78.

12. Fernandes A., King L. C., Guz Y. // Endocrinology. - 1997. - Vol. 138, N 4. - P. 1750-1762.

13. Frankish H. M., Dryden S., Hopkins D. et al. // Peptides. - Vol. 16. - P. 757-771.

14. Gu D., Arnush M., Sarvetnick N. // Pancreas. - 1997. - Vol. 15, N 3. - P. 246-250.

15. Kawamura N., Tamura H., Obana S. // Neuroimmunomodulation. - 1998. - Vol. 5. - P. 9-15.

16. Kohnert K. D., Myrsen Axcrona U., Hehmke B. et al. // Regul. Peptides. - 1999. - Vol. 82. - P. 71-79.

17. Levite M. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1998. - Vol. 95. - P. 12544-12599.

18. Louw J., Woodroof C. W., Wolfe-Coote S. A. // Anat. Rec. - Vol. 247. - P. 405-412.

19. Morgan D. G., Kulkarni R. N., Hurley J. D. et al. // Diabetologia. - 1998. - Vol. 41. - P. 1482-1491.

20. Mulder H., Myrsen-Axcrona U., Gebre-Medhin S. et al. // Microsc. Res. Tech. - 1998. - Vol. 43, N 4. - P. 313-321.

21. Myrsen U., Sandier F. // Regul. Peptides. - 1995. - Vol. 60, N 1. - P. 19-31.

22. Myrsen U., Ahren B., Sandler F. // Diabetes. - 1996. - Vol. 45. - P. 1306-1316.

23. Myrsen-Axcrona U., Karlsson S., Sundler F, Ahren B. // J. Biol. Chem. - 1997. - Vol. 272, N 16. - P. 10790-10796.

24. Myrsen-Axcrona U., Ekblad E., Sundler F. // Regul. Peptides. - 1997. - Vol. 68. - P. 165-175.

25. O’Reilly L., Gu D., Sarvetnick N. et al. // Diabetes. - 1997. - Vol. 46, N 4. - P. 599-606.

26. Paxinos G. B., Watson С. C. The Rat Brain in Stereotaxic Co ordinates. - Sydney, 1986.

27. Persson S. S., Forsgren S., Kjurel U., Tuljedal I. B. // Peptides. - 1998. - Vol. 19. - P. 1233-1240.

28. Sahu A., Sninsky C. A., Kalra P. S., Kalra S. P. // Endocrinology. - 1990. - Vol. 126. - P. 192-198.

29. Schwarz H., Villiger P. M., von Kemps J., Lotz M. //J. Neuroimmunol. - 1994. - Vol. 51. - P. 53-61.

30. Skoglund G., Gross R., Ahren B. // Diabetologia. - 1990. - Vol. 33. - Suppl. - P. 99.

31. Teitelman G., Alpert S., Polak J. M. et al. // Development. - 1993. - Vol. 118, N4-P. 1031-1039.

32. Vettor R., Pagano C., Granzotto M. et al. // Diabetologia. - Vol. 41, N 11. - P. 1361-1367.

33. Waeber G., Hurlimann J., Nicod P., Grouzmann E. // Peptides. - 1995. - Vol. 16. - P. 921-926.


Об авторах

А. В. Траилин

Запорожский государственный медицинский университет


Украина


Ю. М. Колесник

Запорожский государственный медицинский университет


Украина


М. А. Орловский

Запорожский государственный медицинский университет


Украина


Для цитирования:


Траилин А.В., Колесник Ю.М., Орловский М.А. Состояние NPY-синтезирующих клеток островков Лангерганса у нормальных и диабетических крыс при введении синтетического нейропептида Y. Проблемы Эндокринологии. 2001;47(3):36-41. https://doi.org/10.14341/probl11530

For citation:


Trailin A.V., Kolesnik Yu.M., Orlovsky M.A. NPY-Synthesizing cells of Langerhans’ islets in normal and diabetic rats after injection of synthetic neuropeptide Y. Problems of Endocrinology. 2001;47(3):36-41. (In Russ.) https://doi.org/10.14341/probl11530

Просмотров: 43


ISSN 0375-9660 (Print)
ISSN 2308-1430 (Online)