Индольные и олигопептидные фракции ткани эпифиза крысы при осмотическом стрессе

Гормонам эпифиза посвящено множество науч­ных публикаций, однако большинство из них ка­сается мелатонина, максимум секреции которого наблюдается в темное время суток. В литературе преобладает мнение о том, что эпифиз активно секретирует гормоны только ночью, а в светлое время его активность незначительна. Если судить только по мелатонину, то такая точка зрения могла бы быть справедливой, однако эпифиз секретирует в кровь и другие вещества, среди которых особый интерес в силу их высокой биологической актив­ности представляют пептиды [9, 11]. Несмотря на успешное применение в клинике пептидных пре­паратов эпифиза, в частности эпиталамина, для коррекции иммунных, онкологических и эндок­ринных патологий [9], пептидам по сравнению с мелатонином посвящено непропорционально мало работ. Чрезвычайно скудны сведения о циркадной ритмике их секреции. Именно поэтому весьма ак­туально изучение пептидообразования в железе в светлое время суток, когда метаболическая актив­ность пинеалоцитов, связанная с синтезом индола­минов (мелатонина), невелика, и изменения секре­ции пептидных гормонов и серотонина выходят на первый план.

Эпифиз наряду с гипоталамо-гипофизарным комплексом вовлекается в формирование множе­ственных адаптационных ответов организма на стрессовое воздействие, главным образом за счет влияний со стороны верхнего шейного симпатиче­ского ганглия и ЦНС в I фазу общего адаптацион­ного синдрома и за счет действия кортикотропина во II его фазу [1]. Показано, что под влиянием страха, шума, вибрации, иммобилизации, гиперг­ликемии, отсадки потомства у лактирующих жи­вотных, принудительного купания в холодной во­де, а также множества других экстремальных воз­действий усиливается продукция эпифизом мела­тонина и веществ пептидной природы [2, 3]. Мно­гие эффекты гормонов эпифиза проявляются толь­ко при стрессе и выражаются в противодействии стрессорным повреждениям. Как известно, удале­ние эпифиза мало сказывается на жизнеспособно­сти организма, но только до тех пор, пока послед­ний не подвергается какому-либо стрессовому воз­действию. На основании этих данных высказано предположение о том, что эпифиз обеспечивает включение стрессреализующих и стресслимити- рующих механизмов, а в норме его регуляторные влияния на организм невелики [1].

Химическая структура большинства пептидов эпифиза не установлена. К идентифицированным, частично очищенным пептидам железы относятся антигонадотропин (2 и 10 кД), вазотоцин, оксито­цин и вазопрессин. Пептидный фактор 1200 Д, вы­деленный из эпифиза, специфически регулирует транскрипцию ДНК в клетках [14]. Вещества бел­ковой и пептидной природы, секретируемые пи- неалоцитами в ответ на некоторые экстремальные воздействия, возможно, также участвуют в форми­ровании стрессовой реакции организма. Известно, что пептидный препарат эпифиза кринофизин предотвращает гипергликемию, вызываемую вве­дением норадреналина [12]. Инъекции пептидного препарата эпиталамина сопровождались анти- стрессорными эффектами [2, 8].

Существование цитомединов — класса пептид­ных биорегуляторов, осуществляющих связь между малыми группами клеток и оказывающих значи­тельное влияние на их специфическую активность, было показано довольно давно [5, 6, 9]. Цитомеди- ны переносят от клетки к клетке определенную ин­формацию, содержащуюся в последовательности аминокислот и конформационных модификаций. Наибольший эффект цитомедины дают в тканях того органа, из которого они выделены [4]. Тимус и эпифиз были первыми органами, из которых выде­лены фракции низкомолекулярных регуляторных пептидов, обладающих высокой биологической ак­тивностью. Следует отметить, что короткие фраг­менты, состоящие из 3—4 аминокислотных остат­ков, нередко оказываются более активными, чем исходные соединения. Не исключено, что цитоме­дины, образуемые в организме или введенные из­вне, подвергаются процессингу, в результате кото­рого от суммарного комплекса полипептидов от­щепляются фрагменты, состоящие из нескольких аминокислотных остатков и осуществляющие в данный момент необходимые регуляторные функ­ции [4].

В связи с высокой биологической активностью пептидов эпифиза и зависимостью их синтеза от условий среды представлялось интересным изуче­ние гормональных систем саморегуляции эпифиза при стрессе.

Материалы и методы

В опытах использовали 5 интактных крыс (кон­троль) и 5 крыс, подвергнутых 48-часовой водной и пищевой депривации (опыт). Животных декапити- ровали и извлекали эпифиз, который немедленно помещали в микропробирку, наполненную жид­ким азотом. Вся процедура занимала не более 1 мин. Замороженную эпифизарную ткань хранили при —70°С до использования.

Для получения олигопептидной фракции эпи­физы помещали в микропробирку, содержащую 200 мкл 0,1 н. соляной кислоты, нагретой до 95°С на водяной бане, инкубировали при этой темпера­туре 10 мин, охлаждали, гомогенизировали с помо­щью петлевого гомогенизатора, вращаемого со ско­ростью 10 000 об/мин, в течение 1 мин. Гомогенат об­рабатывали ультразвуком 10 мин, инкубировали при 4°С 1 ч, центрифугировали при 8000 об/мин 30 мин, собирали супернатант. Супернатант ней­трализовали до pH 7,0 2М раствором гидроксида калия, замораживали при —20°С 10 мин для полно­го выпадения всех нерастворимых веществ в осадок и после оттаивания снова центрифугировали при 8000 об/мин 10 мин. Супернатант собирали и под­вергали депротеинизации путем добавления ацето­нитрила до концентрации 60 об.%, инкубировали при 85°С 1 мин, замораживали при -20°С 10 мин для полного выпадения всех нерастворимых веществ в осадок и после нагревания до комнатной темпера­туры снова центрифугировали при 8000 об/мин 10 мин. Супернатант отделяли и выпаривали в токе теплого азота при 40°С до объема, приблизительно в 2 раза меньше первоначального объема экстракта. Затем объем экстракта доводили бидистиллирован- ной водой до объема первоначального экстракта, центрифугировали при 3000 об/мин 5 мин.

Полученный депротеинизированный экстракт использовали для анализа методом высокоэффек­тивной жидкостной хроматографии. Хроматогра­фическая система включала в себя 2 насоса высо­кого давления БПЖ-71 и программирующее уст­ройство САА-08 жидкостного хроматографа "Цвет 3110”, динамический и статический смесители (’’Amicone"), петлевой инжектор Rheodyne 7125, предколонку 2x7 мм с сорбентом сепарон С-18 5 мкм, хроматографическую колонку 3 х 150 мм с тем же сорбентом, фотометрический детектор Uvi- cord Sil (LKB) и компьютеризованную систему сбора и анализа хроматографических данных на ба­зе IBM PC 486 с программным пакетом ’’Мульти- хром vl.39”. Для анализа вводили пробу ультра­фильтрата объемом 10—150 мкл и хроматографи­ровали в градиентном режиме со скоростью подачи элюента 320 мкл/мин. Стартовый элюент А — рас­твор однозамещенного фосфата натрия концентра­цией 50 мМ с добавлением 0,15 об.% ортофосфор- ной кислоты; финишный элюент Б -г- элюент А с добавлением 50 об.% ацетонитрила.

1 с, 10% элюента Б; 7200 с (2 ч), 80% элюента Б.

Оптическую плотность регистрировали при длине волны 206 нм. После анализа колонку кон­диционировали при стартовых условиях в течение 20 мин. Для идентификации пиков хроматограммы использовали стандарты мелатонина, серотонина, окситоцина, вазопрессина, вазотоцина, эпиталона.

Результаты и их обсуждение

Данные о значительном усилении образования секреторного материала пинеалоцитами при осмо­тическом стрессе, полученные нами гистологиче­скими методами [3], характеризуют только факт накопления секреторного материала и в меньшей степени — его состав. Результаты электрофизиоло­гических экспериментов также свидетельствовали об активации секреторной активности пинеалоци­тов при стрессе [7]. В связи с этим было предпри­нято исследование индольных и олигопептидных фракций эпифиза методом высокоэффективной жидкостной хроматографии.

При изучении экстрактов эпифиза контрольных крыс и животных, подвергнутых 48-часовой вод­ной и пищевой депривации, выявлено изменение продукции пинеалоцитами серотонина и мелато­нина под действием осмотического стресса. В эпи­физе крыс при стрессе обнаружено приблизитель­но двукратное увеличение содержания серотонина (см. таблицу) при троекратном снижении содержа­ния мелатонина по сравнению с контролем, что

указывает на снижение активности N-ацетил- трансферазы. Причиной таких изменений, скорее всего, является тормозящее действие кортикосте­рона, уровень которого в крови значительно воз­растает во II фазу общего адаптационного синдро­ма, на связывание норадреналина с р-адренорецеп- торами и, таким образом, на путь превращения се­ротонина в мелатонин. Не исключено, что повы­шение содержания серотонина в эпифизе сопрово­ждается также его секрецией в кровяное русло, од­нако это требует дополнительной эксперименталь­ной проверки.

Незначительное содержание в эпифизе мелато­нина на фоне активных секреторных процессов при осмотическом стрессе свидетельствует о том, что в дневное время эпифиз также вовлекается в стрессорный ответ, но секретирует в кровь не ме­латонин, а другие гормоны пептидной природы и серотонин.

Нами обнаружено значительное увеличение фракции гидрофильных высокомолекулярных пеп­тидов (несколько килодальтон) в экстракте эпифи­за при осмотическом стрессе. Вероятно, именно эта фракция составляет основной объем гранул с пептидным содержимым, накопление которых при осмотическом стрессе зарегистрировано в пинеа- лоцитах методами электронной и световой микро­скопии. Кроме того, в эпифизе при осмотическом стрессе зарегистрировано 3,5-кратное увеличение содержания вазопрессина по сравнению с контро­лем. Достоверных изменений содержания оксито­цина или вазотоцина зарегистрировать не удалось.

Наиболее существенными источниками вазо­прессина в эпифизе могут быть нервные терминали из паравентрикулярного и супраоптического ядер гипоталамуса, а также поступление гормона из плазмы крови. Это выглядит правдоподобным, по­скольку при осмотическом стрессе наблюдается усиление продукции вазопрессина гипоталамо-ги- пофизарной системой и увеличение его концентра­ции в плазме крови [10]. Повышение концентра­ции вазопрессина в эпифизе при осмотическом стрессе, вероятно, может иметь регуляторное зна­чение и требует дальнейшего изучения. Незначи­тельные изменения содержания в эпифизе при стрессе окситоцина и вазотоцина могут быть свя­заны с циркадной ритмикой этих гормонов. В ча­стности, пик наибольшей секреции вазотоцина эпифизом приходится на ночные, а не на дневные часы [13].

Выводы

1. Активная секреция эпифизом пептидных гор­монов при таком хроническом виде стресса, как осмотический, скорее всего, носит адаптивный ха­рактер, поскольку пептиды эпифиза препятствуют таким цитотоксическим процессам, как образова­ние свободных радикалов, апоптоз, стрессорная иммунодепрессия.
2. Торможение при осмотическом стрессе син­теза пинеалоцитами мелатонина, адаптогенные свойства которого также хорошо известны, по-ви­димому, определяется характерным для светлого времени суток дефицитом симпатической стимуля­ции железы, а также длительным избытком корти­костерона в крови.