Перекисное окисление липидов и гемостаз у больных инсулинзависимым сахарным диабетом

В последние годы получены данные, свидетельствующие о возможной роли мембранных нарушений в патогенезе инсулинзависимого сахарного диабета (ИЗСД) [1, 2, 7, 19, 20]. Вместе с тем системных исследований, посвященных установлению связи между интенсивностью перекисного окисления липидов (ПОЛ) и клиническими проявлениями заболевания, не проводили, хотя имеются сведения о состоянии мембран при ИЗСД, позволившие допустить роль гипероксидации в утяжелении ИЗСД [1, 10, 14, 19].

Известно, что ИЗСД часто сопровождается нарушениями гемостаза, сопряженными с патологическими изменениями сосудистой стенки [6, 15, 17]. В свою очередь показано, что состояние гемостаза тесно связано с уровнем ПОЛ [4, 11, 12], что изменение одного из этих процессов сопровождается изменением второго [5, 13, 16], что возможно взаимоусиление этих процессов [4]. Установлено, что в динамике развития экспериментального сахарного диабета (СД) можно наблюдать появление пула гиперактивных тромбоцитов, которые вносят существенный вклад в повышение наклонности к тромбообразованию при этом заболевании [18].

То обстоятельство, что при ИЗСД активируются свободнорадикальные процессы, а также наличие связи между интенсивностью ПОЛ и уровнем тромбинообразования, роль тромбоцитов как клеток, через которые в значительной степени реализуется взаимосвязь тромбиногенез — гипероксидация, роль тромбоцитов в осуществлении первичного и коагуляционного гемостаза, их значение в поддержании целостности сосудистой стенки и в непрерывном свертывании крови, наличие тромбогеморрагических осложнений и развитие микроангиопатий при ИЗСД обусловливают необходимость детального исследования состояний тромбоцитарной мембраны при этом заболевании.

Целью работы явилось изучение у больных ИЗСД клинического значения структурно-функционального состояния липидной фазы мембран тромбоцитов, процессов ПОЛ и агрегационной активности тромбоцитов наряду с показателями, характеризующими коагуляционный гемостаз.

Материалы и методы

Обследовано 358 больных ИЗСД (186 мужчин и 172 женщины), из них у 112 диагностировано неосложненное течение СД, у 141 — ИЗСД с микроангиопатиями, а 105 больных ИЗСД находились в состоянии кетоацидоза. Средний возраст пациентов составил 29,1 ±1,3 года. Продолжительность заболевания составляла от 1 года до 20 лет, средняя потребность в инсулине — 45 ± 0,9 ЕД в сутки. В качестве группы сравнения обследовано 53 здоровых человека идентичного возраста без отягощенного семейного анамнеза по СД.

Определение содержания основных фракций фосфолипидов (ФЛ) — лизофосфатидилхолинов (ЛФХ), фосфатидилсеринов (ФС), сфингомиелинов (СМ), фосфатидилхолинов (ФХ), фосфатиди- лэтаноламинов (ФЭА) и холестерина (ХС) клеточных мембран проводили методом тонкослойной хроматографии. В мембранах тромбоцитов определяли содержание диеновых конъюгатов (ДК), шиффовых оснований (ШО). Об активности ан- тирадикальной защиты судили по содержанию су- пероксиддисмутазы (СОД), каталазы и активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (Г-6-ФДГ). В мембранах тромбоцитов исследовали активность ферментов трансмембранного переноса ионов Na⁺-, К⁺-, Mg²⁺- и Са²⁺-АТФаз. Фотометрическим методом определяли АДФ-индуцирован- ную агрегацию тромбоцитов с определением максимальной агрегации, начальной скорости агрегации, времени достижения 1/2 максимальной агрегации (Т|у₂), времени агрегации с помощью агрегометра "Биомак".

Полученные результаты подвергли математической обработке методом вариационной статистики с помощью пакета прикладных программ по статистической обработке информации (SPSS), а также пакета анализа Microsoft Excel на ЭВМ IBM PC (486 DX4).

Рис. 1. Содержание продуктов ПОЛ в мембранах тромбоцитов у больных ИЗСД

а — содержание ДК (в ммоль/мл); б — содержание ШО (в усл. ед.). Здесь и на рис. 2, 3: 1 — здоровые; 2 — ИЗСД без осложнений; 3 — ИЗСД с микроангиопатиями; 4 — ИЗСД с кетоацидозом. * — р < 0,05.

Результаты и их обсуждение

В результате проведенных исследований у больных ИЗСД в зависимости от особенностей клинических проявлений обнаружены значительные изменения липидной фазы мембран тромбоцитов. Необходимо отметить, что уже у больных с неосложненным ИЗСД в мембранах тромбоцитов накапливаются ДК, содержание их повышается при появлении сосудистых осложнений, а максимальных величин показатели ДК достигают у больных ИЗСД в состоянии кетоацидоза, как это наблюдали и другие исследователи [1]. Повышение содержания ШО в мембранах тромбоцитов у больных с неосложненным ИЗСД расценено нами как компенсаторно-приспособительная реакция, направленная на нейтрализацию процессов гипероксидации [8], которая утрачивается при прогрессировании ИЗСД и присоединении микроангиопатий (рис. 1).

В наших исследованиях у больных ИЗСД без осложнений (рис. 2) в клеточных мембранах тромбоцитов установлено достоверное повышение активности СОД по сравнению с показателями у здоровых. Повышение активности СОД у больных ИЗСД без сосудистых осложнений, по-видимому, носит защитный характер и отражает адаптационные возможности организма [10]. У больных ИЗСД с наличием микроангиопатий активность СОД достоверно снижается по сравнению с показателями у больных ИЗСД без сосудистых осложнений, кетоацидоз у больных ИЗСД также сопровождается снижением активности СОД, что согласуется с исследованиями Л. А. Литвиненко [9].

В наших исследованиях антирадикальный эффект каталазы также повышен у больных ИЗСД без осложнений, в то же время у больных* в состоянии кетоацидоза происходит значительное снижение активности каталазы по сравнению с показателями у больных ИЗСД без осложнений.

Активность Г-6-ФДГ у больных ИЗСД с неосложненным течением снижена в отличие от активности данного фермента у здоровых лиц. При наличии микроангиопатий у больных ИЗСД активность Г-6-ФДГ наименьшая, что может косвенно свидетельствовать о выраженной гипероксидации у обсуждаемой группы больных. Таким образом, на основании иссле-

Рис. 2. Показатели активности антиоксидантных ферментов в мембранах тромбоцитов у больных ИЗСД.

а — активность СОД (в усл. ед. торм/мг белка); б — активность Г-6-ФДГ (в млн ед. акт/мг белка); в — активность каталазы (в мкмоль/мин/мг белка).

дований можно предположить, что с нарастанием длительности и тяжести ИЗСД процессы ПОЛ интенсифицируются в такой степени, при которой компенсаторные возможности системы антиоксидантной защиты оказываются недостаточными.

Нарушение равновесия между про- и антиоксидантными механизмами клеточных мембран является одной из основных причин структурной перестройки липидной фазы мембран у больных ИЗСД (табл. 1). При сравнении нарушений фосфолипидного состава мембран тромбоцитов у больных ИЗСД без осложнений и у больных ИЗСД с микроангиопатиями видно, что повышение содержания ЛФХ и снижение уровня ФХ происходит при обеих клинических группах ИЗСД. Уровень ФС, ФЭА и суммарных ФЛ ниже в мембранах тромбоцитов у больных ИЗСД с микроангиопатиями. Содержание ХС и увеличение коэффициента отношения ХС/ФЛ также более выражено у больных ИЗСД с сосудистыми осложнениями.

В связи с обнаруженными нами изменениями структурно-функционального состояния мембран тромбоцитов у больных ИЗСД изучение агрегационной активности и гемореологических наруше-

Таб ли ца 1

Содержание основных фракций ФЛ и ХС в мембранах тромбоцитов у больных ИЗСД (в ммоль/мл; М ± т)

Примечание. Здесь и в табл. 2: звездочки — достоверность различий: одна — между показателями здоровых и больных ИЗСД без осложнений, две — между показателями больных ИЗСД без осложнений и больных ИЗСД с микроангиопатиями.

Рис. 3. Количество тромбоцитов (в тыс/мкл) и их агрегационная активность (максимальное светопропускание; в %).

I — количество тромбоцитов; II — агрегационная активность.

ний, а также определение их связи с дестабилизацией липидной фазы мембран тромбоцитов представляет большой интерес.

В настоящей работе установлено, что у больных ИЗСД без осложнений достоверно уменьшено абсолютное количество тромбоцитов крови, одновременно с этим снижена АДФ-индуциро- ванная агрегационная активность данных клеток крови на 27% по сравнению с показателями у здоровых (рис. 3). Механизм агрегации тромбоцитов, вызываемый АДФ, окончательно не выяснен. Это энергетически зависимая реакция, которая осуществляется только активными в метаболическом отношении тромбоцитами [3]. Наряду с изменением агрегационной способности тромбоцитов у больных ИЗСД без осложнений установлено изменение характера агрегатограм- мы: достоверно уменьшаются ^и начальная

скорость агрегации по сравнению с показателями у здоровых, в то же время достижение максимальной агрегации у больных ИЗСД без осложнений практически не отличается от показателей у здоровых. Можно предположить, что у больных с неосложненным ИЗСД преобладает необратимая фаза агрегации, которая обусловлена комплексом влияния нескольких агрегирующих агентов (АДФ, тромбина, коллагена и т. д.); нельзя исключить влияние повреждения сосудистой стенки, при которой агрегация практически всегда протекает как необратимый процесс и способствует внутрисосудистому тромбообразо- ванию. При этом установлено, что при компенсации СД наблюдается тенденция к нормализации показателей начальной скорости агрегации И Т_1/2.

Механизм связи между гемокоагуляцией и ПОЛ можно представить следующим образом: продукты ПОЛ, накапливающиеся при состоянии напряжения, атакуют ФЛ клеточных мембран, вызывая в экстремальных ситуациях повреждения, пропорциональные степени активации ПОЛ [4]. Структурно-функциональные изменения мембран — причина экспрессии неполного и тканевого тромбопластинов (феномен "флип-флоп"), в результате которого на плазматическую мембрану перемещаются ФЛ, свойственные внутреннему компоненту липидного бислоя. Это повышает коагуляционную активность клеток крови и клеток сосудистого эндотелия [3, 4, 13]. Изменения липидного бислоя мембран при активации ПОЛ, кроме того, ускоряют синтез тромбоксана В₂ и простациклина. Их соотношение сдвигается в пользу тромбоксанов, что может обусловливать гиперкоагуляцию. При длительной активации ПОЛ происходят выраженные метаболические изменения на уровне мембран тромбоцитов, что энергетически истощает данные клетки крови; с другой стороны, активация ПОЛ, изменение фосфолипидного состава мембран тромбоцитов, повышение агрегационного потенциала данных клеток крови способствуют повышению активности внутрисосудистого свертывания крови [16], и оба фактора, оказывая влияние на АДФ-индуциро- ванную агрегацию тромбоцитов, вызывают ее угнетение.

Данное предположение подтверждается проведенным корреляционным анализом между активностью ПОЛ, фосфолипидным составом мембран тромбоцитов, уровнем антиоксидантных ферментов и агрегационной способностью данных клеток крови. Установлена достоверная корреляционная связь между уровнем ДК и АДФ- индуцированной агрегацией тромбоцитов (г = —0,7; р < 0,001), между ШО и АДФ-индуци- рованной агрегацией (г = —0,5; р < 0,05), между ШО и Tj/2 О* ⁼ ~0,7; р > 0,05). Анализируя полученные корреляционные связи, можно предположить, что активация ПОЛ способствует изменению функциональных способностей тромбоцитов, что выражается в снижении ответа данных клеток крови на индукцию АДФ. Из полученных взаимосвязей структурно-функционального состояния мембран тромбоцитов с показателями агрегационной активности тромбоцитов наибольший интерес представляет положительная взаимосвязь уровня ЛФХ в мембранах тромбоцитов с уровнем АДФ-индуцированной агрегации (г = 0,85; р < 0,05), так как накопление ЛФХ в клеточных мембранах тромбоцитов неразрывно связано с гемолизирующим влиянием на клеточные мембраны и выходом в кровеносное русло АДФ — химического индуктора агрегации тромбоцитов.

Исследование гемокоагуляционных изменений у больных ИЗСД (табл. 2) свидетельствует о наличии у данных пациентов непрерывного внутрисосудистого свертывания (ДВС) крови в стадии гипокоагулемии потребления при одновременной активации противосвертывающих механизмов (рост общей антитромбиновой активности), появлении положительных паракоагуляционных проб.

Исследование тромбоцитарного звена гемостаза у больных ИЗСД с микроангиопатиями свидетельствует об однонаправленности изменений, как и у больных ИЗСД с неосложненным течением.

Нами установлено также, что агрегационная активность тромбоцитов у больных ИЗСД с микроангиопатиями зависит от компенсации СД. На фоне компенсации СД происходит повышение способности тромбоцитов к АДФ-иду- цированной агрегации тромбоцитов до 78% по сравнению с 62% у больных ИЗСД с микроангиопатиями на фоне декомпенсированного углеводного обмена. Возможно, это обусловлено тем, что компенсация СД сопровождается уменьшением интенсивности ДВС-синдрома у

Таблица 2

Показатели гемокоагуляции у больных ИЗСД

больных ИЗСД, одновременно с этим увеличивается количество метаболически активных тромбоцитов, которые способны ответить на индукцию АДФ.

Результаты коагуляционных нарушений у больных ИЗСД (см. табл. 2) свидетельствуют о достоверном удлинении активированного времени свертывания по сравнению с показателями у больных ИЗСД с неосложненным течением, при этом частота паракоагуляционных проб у больных ИЗСД с микроангиопатиями увеличивается на 6,1% по сравнению с показателями у больных ИЗСД без микроангиопатий, это свидетельствует о более выраженном ДВС-синдроме у больных ИЗСД с микроангиопатиями на стадии гиперкоа- гулемии потребления.

Чрезвычайно актуально изучение тромбоцитарно-коагуляционного гемостаза у больных ИЗСД в состоянии кетоацидоза. Установлено, что у больных ИЗСД в состоянии кетоацидоза АДФ-индуцированная агрегация имеет наименьшую величину по сравнению с показателями у больных ИЗСД с неосложненным течением и наличием микроангиопатий (см. рис. 3). Это, вероятно, обусловлено глубокими метаболическими нарушениями тромбоцитов у обсуждаемой группы больных. В то же время изменяется характер агрегатограммы — достоверно значимо укорачивается время максимальной агрегации по сравнению с показателями у больных ИЗСД с микроангиопатиями и с неосложненным течением (р < 0,001). Принимая во внимание результаты исследования, можно предположить, что выраженные изменения тромбоцитарного гемостаза у больных ИЗСД в состоянии кетоацидоза во многом обусловлены нарушением фосфолипидного состава клеточных мембран тромбоцитов. Это подтверждается наличием корреляционной связи между уровнем ХС в мембранах тромбоцитов у обсуждаемой группы больных и АДФ-индуцированной агрегацией тромбоцитов (г = —0,58; р < 0,05), отношением ХС/ФЛ и АДФ-индуцированной агрегацией тромбоцитов (г = —0,49; р < 0,04). Результаты исследования гемокоагуляционного гемостаза у больных ИЗСД в состоянии кетоацидоза свидетельствуют о наиболее выраженных изменениях в системе гемостаза у обсуждаемой группы больных: показатели активированного времени рекальцификации и частично активированного времени рекальцификации достигают максимальных величин по сравнению с показателями у больных ИЗСД без осложнений и с микроангиопатиями (см. табл. 2). В то же время у больных ИЗСД в состоянии кетоацидоза достоверно повышается антитромбиновая активность, сохраняется тенденция к снижению уровня фибриногена и повышению содержания продуктов деградации фибрина в 3 раза больше, чем у больных ИЗСД без осложнений и с микроангиопатиями. Полученные результаты свидетельствуют о наличии у обсуждаемой группы больных выраженного ДВС-синдро- ма, протекающего одновременно с активацией ПОЛ и неразрывно связанного с ним.

Таким образом, исследование мембран тромбоцитов у больных ИЗСД свидетельствует о нарушении структурно-функционального состояния мембран этих клеток крови, активации ПОЛ, нарушении тромбоцитарно-коагуляционного звена гемостаза и неразрывной связи реологических нарушений с активацией ПОЛ, зависимости данных проявлений от клинических вариантов ИЗСД, длительности заболевания и компенсации углеводного обмена.

Выводы

1. У больных ИЗСД имеет место структурнофункциональная дестабилизация липидной фазы клеточных мембран тромбоцитов. Данные изменения усугубляются по мере прогрессирования ИЗСД.
2. Одним из механизмов, приводящих к дестабилизации клеточных мембран тромбоцитов у больных ИЗСД, являются избыточная активность ПОЛ, а также снижение антиоксидантной защиты клеточных мембран в виде изменения активности антиоксидантных ферментов.
3. Мембранопатологические процессы в тромбоцитах у больных ИЗСД зависят от клинических особенностей ИЗСД, длительности заболевания и компенсации СД.
4. Дисбаланс в системе прооксиданты — антиоксиданты в сторону интенсификации ПОЛ в тромбоцитах больных ИЗСД приводит к изменению агрегационной способности тромбоцитов, что играет важную роль в формировании ДВС- синдрома, последнее предопределяет появление и прогрессирование ангиопатий.