Влияние физико-химических факторов in vitro на гормондепонирующую способность эритроцитов человека

Таблица 1 Влияние pH инкубационной среды на гормондепонирующую способность эритроцитов человека (М ± т) Плазма крови (/7 - 9) Буфер pH 6,0 (п = 8) Буфер pH 7,4 (/7 = 8) Буфер pH 9,0 (л = 8) ъ Т4 Тз т4 Тз Т4 Т3 т4 1,54 ± 0,09 Р Р\ 75,9 ± 10,3 5,24 ± 1,01 < 0,01 < 0,05 557,3 + 10,1 < 0,01 10,10 ± 1,33 < 0,01 544,1 ± 39,4 < 0,01 8,20 ± 1,60 < 0,01 566,4 ± 8,3 < 0,01 Примечание, р - достоверность различий с аутоплазмой; р{ - достоверность различий с буфером pH 7,4. Здесь и в табл. 2: п - число наблюдений; Т3 - трийодтиронин, Т4 - тироксин. Проблема физиологической роли гормовдепонирующей функции эритроцитов обсуждается в научной литературе на протяжении 3 десятилетий. Пионерскими работами в данном направлении являются исследования Л. И. Сандуляка, в которых была предпринята попытка рассмотреть общебиологическое значение инсулин- депонируюшей функции эритроцитов [3], а также сформулирована гипотеза об участии эритроцитов в системе депо и транспорта инсулина [3, 4].Позже экспериментально доказано участие эритроцитов млекопитающих в депонировании тиреоидных гормонов [6, 7]. Поданным исследователей, содержание гормонов щитовидной железы в эритроцитах по меньшей мере на порядок превосходит их уровень в плазме крови. Однако отсутствие единого взгляда на роль эритроцитарного пула гормонов является причиной, сдерживающей теоретическое обоснование обшебиологического значения данного явления. По нашему мнению, решение этой проблемы может существенно облегчить понимание патогенеза многих эндок- ринопатий и содействовать разработке принципиально новых методов коррекции нарушений гормонального статуса организма. Таким образом, учитывая отсутствие прямого афферентного влияния со стороны основных интегрирующих систем организма на эритроцит, мы осуществили экспериментальную проверку двух предположений: 1) о регулирующем влиянии факторов внутрисосудистой жидкости (наличие белка в среде, величина pH инкубационной среды) на способность эритроцитов человека депонировать тиреоидные гормоны; 2) о влиянии мембранотропного эффекта ультрафиолетового излучения на гормондепонирующую функцию эритроцитов человека. Материалы и методы Влияние величины pH инкубационного раствора на способность эритроцитов человека депонировать тиреоидные гормоны исследовали на 9 образцах крови с использованием 0,15 М фосфатного буферного раствора, не содержащего белка, при значениях pH 6,0, 7,4 и 9,0. Инкубацию осуществляли на водяном термостате при температуре 37°С. Соотношение объема инкубационной среды и объема эритроцитной массы составляло 1:1. После завершения инкубации суспензию эритроцитов центрифугировали, а в инкубационной среде определяли концентрацию тиреоидных гормонов с помощью радиоиммунного анализа. Ультрафиолетовое облучение образцов крови проводили в одноразовых Таблица 2 Влияние ультрафиолетового облучения крови доноров на уровни в плазме Т3, Т4 и тиреоглобулина (М ± т) Экспозиция, мин Т3, нмоль/л Т4, нмоль/л Тиреоглобулин, нг/мл 0 (л = 22) 1,41 ± 0,06 98,8 ± 4,8 39,12 ± 5,77 2 (л = 15) 1,68 ± 0,08 р < 0,05 95,3 + 5,8 39,50 ± 8,10 10 (л = 22) 2.15 ± 0,12 р < 0,001 90,4 ± 5,4 41,78 ± 6,54 20 (л = 15) 3,90 + 0,17 р < 0,001 88,4 + 6,5 36,14 ± 7,12 30 (л = 8) 3,09 + 0,21 р < 0,001 82,0 ± 8,9 37,83 ± 5,24 Примечание, р - достоверность прироста концентрации Т3 под действием ультрафиолетового облучения по сравнению с необлученной кровью. стерильных чашках Петри. Толщина облучаемого слоя крови составляла 1 мм. Источником ультрафиолетового излучения была выбрана ртутная лампа ДРБ-8. Облученность поверхности крови составляла 15,5 Вт/м2, продолжительность экспозиции - от 2 до 30 мин. После облучения кровь центрифугировали, а в полученных образцах плазмы определяли уровень тиреоидных гормонов с помощью радиоиммунного метода. Определение концентраций тиреоидных гормонов тиреоглобулина проводили с использованием стандартных диагностических наборов РИО-Т4-ПГ, РИО- ТЗ-ПГ, РИО-ТГ-|231 производства Института биоорганической химии (Беларусь). Радиометрический анализ проб проводили в измерительном комплексе "Гамма -12" (Россия). Результаты и их обсуждение В табл. 1 приведены данные о влиянии величины pH инкубационной среды на способность эритроцитов человека депонировать тиреоидные гормоны. Анализируя полученные данные, можно сделать вывод о том, что замена плазмы крови на безбел- ковый солевой раствор является причиной значительных изменений свойств гормондепонирующей функции эритроцитов. При инкубации эритроцитной массы в буферном растворе с величиной pH 6,0 концентрация тироксина и трийодтиронина в инкубационной среде превышает концентрацию гормонов в плазме крови в 7,3 и 3,4 раза соответственно. При величине pH 7,4 концентрация тироксина и трийодтиронина превышает аналогичные показатели в аутоплазме в 7,2 и 6,6 раза соответственно. При этом концентрация трийодтиронина в буферном растворе с величиной pH 6,0 достоверно меньше (в 1,9 раза) по сравнению с таковой в буферном растворе pH 7,4, а концентрация тироксина в упомянутых инкубационных средах достоверно не различается. Данные табл. 2 показывают, что уже после 2-минутной экспозиции под влиянием ультрафиолетового облучения уровень трийодтиронина в плазме крови увеличивается на 104% по сравнению с необлученными образцами. При экспозиции 30 мин содержание трийодтиронина возрастает в 4,8 раза. При этом не зарегистрировано достоверных сдвигов концентрации тироксина и тиреоглобулина под действием ультрафиолетового излучения. Корреляционный анализ показал отрицательную связь между уровнем трийодтиронина и показателем тиреоидного индекса в необлученных образцах (г =-0,667; р < 0,01) и при ультрафиолетовом облучении с экспозицией 2 и 10 мин (г = -0,740 и г = -0,714; р < 0,01 соответственно). Представленные в нашем сообщении данные привлекают к себе внимание по двум причинам. Во-первых, выбранный нами класс физиологически активных веществ - йодированные производные аминокислот - уникальны не только своими химическими свойствами. Как известно, истинным гормоном щитовидной железы является тироксин, а его биологически активная производная - трийодтиронин образуется в тканях за счет 5'-монодейодирования [1]. Поэтому любая информация, расширяющая наши представления о механизмах транспорта данных гормонов, имеет важное теоретическое и практическое значение. Во-вторых, сведения о факторах плазмы крови, способных оказать влияние на гормондепонирующую функцию эритроцитов, указывают направление поиска экспериментальных доказательств целесообразности наличия эритроцитарного пула гормонов. Такая постановка вопроса позволяет, на наш взгляд, более полно проанализировать представленные результаты. Сопоставив данные табл. 1 и 2, можно сделать несколько, как нам представляется, существенных выводов, а именно: - количество депонированных в эритроцитах человека тироксина и трийодтиронина во много раз превосходит концентрацию этих веществ в плазме крови; — белки плазмы крови выполняют весьма важную функцию в регуляции гормовдепонирующей способности эритроцитов; — как в случае инкубации эритроцитной массы в буферных растворах с различной величиной pH, так и при воздействии ультрафиолетового облучения на образцы цельной крови обнаружена закономерная динамика уровня трийодтиронина в отличие от тироксина. С нашей точки зрения, роль белков плазмы крови в реализации гормондепонирующей функции эритроциов заслуживает углубленного исследования. Не исключено, что белки крови, в первую очередь альбумины, являясь полианионами, определенным образом ориентируют фосфолипидные молекулы плазматической мембраны эритроцитов [2], облегчая нековалентное связывание полярными группировками фосфолипидов галогенизированных углеводов, каковыми являются тиреоидные гормоны. В то же время эритроциты человека обладают способностью депонировать не только трийодтиронин, но и его физиологически менее активный предшественник - тироксин. Если предположить, что биологическое назначение эрироцитарного пула тироксина и трийодтиронина состоит в оптимизации транспорта гормонов к компетентным тканям, то правомерно поставить вопрос об адекватных стимулах, определяющих количественные параметры заполнения и использования эритроцитарного депо. Выбранный нами интервал величин pH инкубационного раствора, конечно, не соответствует физиологическому диапазону значений, характерных для данного показателя. Однако модель, предусматривающая анализ зависимости количественных показателей эрироцитарного пула тиреоидных гормонов от величины pH среды, является достаточно перспективной, поскольку тиреоидные гормоны - одни из наиболее мощных регуляторов энергетического обмена клетки, а скорость генерации протонов - весьма важный показатель интенсивности обменных процессов в организме. Обсуждая перспективность использования ультрафиолетового облучения в качестве простого и надежного теста трийод- тирониндепонирующей способности эритроцитов, уместно сделать несколько замечаний. Корреляционный анализ параметров тиреоидного статуса не выявил отрицательной корреляции между уровнями тироксина и трийодтиронина. Также не обнаружено статистически значимого изменения концентрации тиреоглобулина на фоне возрастающей концентрации трийодтиронина. Совокупность приведенных фактов свидетельствует о том, что зависимое от продолжительности экспозиции ультрафиолетового облучения возрастание уровня трийодтиронина не является следствием фотоактивации конверсии тироксина, а обусловлено выходом депонированной формы гормона. В противном случае существовала тесная отрицательная корреляция между содержанием тироксина и трийодтиронина, а концентрация тиреоглобулина снижалась пропорционально степени фотоактивации конверсии тироксина и высвобождении йода [5]. Таким образом, полученные нами результаты свидетельствуют о том, что фонд тиреоидных гормонов, депонированных в эритроцитах человека, во много раз превышает концентрацию данных веществ в плазме крови, а ультрафиолетовое облучение in vitro образцов цельной крови можно использовать как простой и эффективный тест в лабораторной практике. Выводы 1. Эритроциты человека обладают способностью депонировать значительные количества тироксина и трийодтиронина. 2. In vitro установлено, что на гормондепонирующую способность эритроцитов оказывают влияние физико-химические (величина pH и наличие белка в инкубационной среде) и физические (ультрафиолетовое облучение, X = 254 нм) факторы.