Влияние анксиогенного стресса на чувствительность к глюкокортикоидам, толерантность к глюкозе и устойчивость к действию аллоксана у крыс

Экспериментальные стрессорные воздействия вызывают развитие тахифилаксии к глюкокортикоидным гормонам (ГКГ) и одновременное увеличение чувствительности к инсулину у крыс [2, 10]. Этот феномен можно рассматривать как вероятный механизм протективного действия стресса в отношении диабетогенного эффекта аллоксана [2]. Повторные эпизоды иммоби- лизационного стресса увеличивают устойчивость крыс к гепа- тотоксическому действию аллоксана, снижают темп падения массы тела у животных после его введения, но не влияют на выраженность гипергликемии при аллоксановом диабете [2. 10]. Тот же режим стрессирования приводит к развитию симптомо- комплекса, который рассматривается в нейроиммуноэндокринологии как sickness behavior (поведение болезни - ПБ, [15]. ПБ-подобная симптоматика проявляется угнетением спонтанного ориентировочно-исследовательского поведения крыс на фоне прироста активности интерлейкина-1 (ИЛ-1) и фактора некроза опухоли (ФИО) в сыворотке крови, а также одновременным увеличением устойчивости к острой гипоксии [10]. Следует добавить, что ИЛ-1 обладает антиглюкортикоидной [17] и гипогликемизирующей [19] активностью, а устойчивость к гипоксии является основой переносимости разнородных неблагоприятных воздействий [8].Одним из факторов ПБ-ассо- циированной депрессии и устойчивости к гипоксии может быть постстрессорное нарастание церебральной активности моно- а.миноксидазы - МАО (амин: кислород оксидоредуктаза (дезаминирующая), (содержащая флавин); КФ 1.4.3.4), являющейся Табл и ца 1 Влияние повторных эпизодов иммобилизационного стресса и аллоксана на поведение в "открытом поле”, церебральную активность МАО-Б и уровень гликемии у крыс (М ± т) Показатель Серия эксперимента Контроль Стресс Контроль + аллоксан Стресс + аллоксан Локомоция (смена квадратов) Исследовательское поведение (выглядывание через отверстие) Ориентировочная реакция (вертикальные стойки) Груминг Анксиогенная дефекация Активность МАО-Б, нМ/мозг/в 1 мин Гликемия, мМ/л Примечание. После исходного тестирования в "открытом поле" (серия I) крыс наркотизировали диэтиловым эфиром и внутрибрюшинно вводили им аллоксана тригидрат (200 мг/кг) или эквиобъемное количество 0,9% NaCl, через 72 ч проводили повторное тестирование (серия II). Одна звездочка - различия достоверны между сериями I и И; две звездочки - различия достоверны между группами "контроль" и "стресс"; "контроль" и "контроль + аллоксан"; три звездочки - различия достоверны между группами "контроль + аллоксан" и "стресс + аллоксан". Статистическая обработка проведена с использованием критериев Стьюдента, Вилкоксона-Манна-Уитни и Колмогорова- Смирнова; различия считали достоверными при р < 0,05. объектом разносторонней ГКГ- и цитокинзависимой регуляции [10, 14, 18], осуществляющей катаболизм моноаминов-ней- ротрансмиттеров и во многом определяющей нейрохимический контроль поведения [5]. Вполне возможно, что постстрессорное нарастание инсу- линчувствительности, как и увеличение активности МАО мозга, является вторичным феноменом по отношению к нитокинзави- симому ограничению эффектов ГКГ. Не исключено также, что устойчивость к диабетогенному действию аллоксана может быть неспецифическим следствием тканевой толерантности к гипоксии, вероятно, проявляющейся и на уровне р-клеток поджелудочной железы. Логично предположить, что состояния, связанные со сниженной переносимостью гипоксии, могут сопровождаться нарастанием чувствительности к диабетогенному эффекту р-цитотоксических факторов. Целесообразность экспериментальной проверки этого предположения обусловлена непрерывно прогрессирующей деструкцией панкреатических Р-клеток у больных инсулинзависимым сахарным диабетом [1]. Представленная статья посвящена рассмотрению чувствительности к ГКГ, толерантности к глюкозе и особенностей аллоксанового диабета у крыс, предварительно подвергнутых стрессированию по специально подобранному режиму, который понижает устойчивость к гипоксии на фоне тревожно-депрессивных расстройств поведения. Материалы и методы Исследование выполнено на 202 белых беспородных крысах массой 140-180 г. Для моделирования стресса применяли 4-кратную иммобилизацию животных по методу В. Э. Цейлик- мана и соавт. [11]. Длительность однократной иммобилизации составляла 60 мин, стрессорные воздействия повторяли с интервалом 72 ч. В качестве контроля использовали животных, не подвергавшихся иммобилизациям. Через 24 ч после завершения последнего сеанса иммобилизации исследовали поведение крыс в "открытом поле" (1 серия тестирования) [12]. Затем животных распределяли по экспериментальным группам, в которых отдельно изучали толерантность к глюкозе, чувствительность к диабетогенному действию аллоксана, содержание цитокинов в крови, устойчивость к острой гипоксической гипоксии, чувствительность к ГКГ. За 1 сут до постановки этих экспериментов животных лишали пищи при сохранении доступа к воде. Толерантность к глюкозе оценивали по уровню гликемии через 60 и 120 мин после внутрибрюшинного введения 40% раствора глюкозы в дозе 4 г/кг [7]. Диабет вызывали путем внутрибрюшинного введения 4% раствора аллоксана тригидрата ("LaChema", Чехия) в дозе 200 мг/кг. Контрольным животным вводили эквиобъемное количество 0,9% NaCl. Через 72 ч после инъекции аллоксана или 0,9% NaCl натощак животных повторно тестировали в "открытом поле" (II серия тестирования) и де- капитировали под эфирным наркозом с целью получения крови и ткани головного мозга. О выраженности диабетогенного действия аллоксана судили по показателям гликемии. Концентрацию глюкозы в сыворотке крови определяли глюкозоксидазным методом. Дополнительно в гомогенате ткани головного мозга определяли активность МАО с солянокислым бензиламином в качестве субстрата [12]. Поскольку иммобилизационный стресс может вызвать изменение удельного содержания белка и воды в тканях, активность фермента рассчитывали на цельный орган (абсолютная ферментативная активность). Содержание цитокинов (ИЛ-1, ФИО, ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-6, ИЛ-12) в сыворотке крови стрессированных крыс определяли иммуноферментным методом с помощью стандартного набора реагентов "Quantinkine" (США). Результат учитывали на планшетном фотометре "Multiscan plus" (Labsystems, Финляндия). Устойчивость к гипоксии изучали с помощью метода В. И. Ку- линского, модифицированного нами для работы с крысами [12] (принцип метода заключается в регистрации латентности развития гипоксической комы). Чувствительность к ГКГ оценивали по уровню гликемии и относительной массе лимфоидных органов (тимус и селезенка) через 96 ч после подкожного введения пролонгированного глюкокортикоидного препарата [12]. Для этой цели использовали триамцинолона ацетонид - ТА (кеналог, "VebBerlin-Chemie", Германия) в дозе 2 мг/кг. Контрольным животным вводили эквиобъемное количество 0,9% NaCl. Результаты обработаны статистически. О достоверности различий судили по критериям Стьюдента (Г), Вилкоксона-Манна-Уитни (U), Розенбаума (Q), Колмогорова-Смирнова (А.) и точному критерию Фишера (ТКФ). Для оценки связей между изучаемыми параметрами применяли экспоненциальный корре- ляцинно-репэессионный анализ, а также рассчитывали коэффициенты корреляции рангов по Спирмену (rs) и Кенделу (гД. Результаты и их обсуждение Изученный режим 4-кратного иммобилизационного стресса уменьшал латентность развития гипоксической комы с 95,9 ± 4,2 с в контроле до 88,0 ± 3,3 с в обоих случаях (п = 10; р < 0,05/U) и одновременно вызывал снижение поведенческой активности крыс. Это проявилось уменьшением показателей локомоции животных в серии тестировании в "открытом поле" (табл. 1). Параллельно наблюдалось увеличение показателя дефекации, что отражает тревожно-депрессивную природу стресс- индуцированных расстройств поведения [6] и свидетельствует о их гомологичности с меланхолической депрессией [16]. Полученные результаты позволяют рассматривать изученный режим 4-кратной иммобилизации крыс как модель анксиогенных нарушений поведения у человека, которые часто встречаются при хронической патологии, в том числе при сахарном диабете типа 1 [3]. Данный тип психических расстройств расценивают как следствие гипоталамической гиперпродукции кортиколиберина (КД), который рассматривается как медиатор стрессогенной тревожности, вызывающий состояние "сверхбодрствования” и центральную активацию симпатико-адреналовой системы [16]. Это может привести к увеличению потребности в кислороде за счет стимуляции p-адренорецепторов, определяющей снижение устойчивости к гипоксии [8]. По-видимому, активация эритропоэза, продемонстрированная ранее при изучаемом режиме стрессирования [11], направлена на компенсацию сниженной устойчивости к гипоксии. Аналогичную роль играет стрессогенное уменьшение двигательной активности. Это иллюстрируется отрицательной корреляцией между показателем локомоции стрессированных крыс в "открытом поле" и длительностью развития гипоксической комы (г5 = -0,71; р < 0,05). Постстрессорные сдвиги чувствительности к ГКГ характеризовались заметной избирательностью. Изученный режим предотвращал гипоплазию тимуса под действием ТА, но не влиял на степень ТА-индуцированного уменьшения селезеночного индекса и на гипергликемизирующий эффект глюкокортикоидного препарата (табл. 2). Тимический индекс животных, получавших ТА после стресса, положительно коррелировал с показателем анксиогенной дефекации (гА- = 0,57; р < 0,05). Это подтверждает предположение о тревожно-депрессивной природе постстрессорного снижения локомоции крыс, так как гиперпродукция КЛ при меланхолической депрессии обусловлена уменьшением чувствительности к ГКГ на уровне гипоталамуса и (или) гиппокампа [16]. По-видимому, изученный режим стрессирования способствует параллельной десенситизации ГКГ-рецепторов вилочковой железы и лимбических структур мозга, что обусловливает устойчивость тимуса к гипоплазирую- щему действию ГКГ и одновременное нарушение регуляции ги- поталамо-гипофизарно-надпочечниковой системы по механизму "длинной петли" отрицательной обратной связи. Таблица 2 Влияние повторных эпизодов иммобилизационного стресса и триамцинолона ацетонида (2 мг/кг) на относительную массу лимфоидных органов и уровень гликемии у крыс (М ± т) П Г» If Я ЯЯТР П R Контроль Стресс Контроль + Стресс + ТА 1 1\Лхиос1 1 VJl о («= 12) (л = 12) ТА (и = 12) (л = 12) Тимический индекс, мг на I г мас- сы тела 1,64±0,10 1,65±0,11 0,96 ± 0,12* 1,34 ± 0,12** Селезеноч ный индекс, мг на 1 г мас сы тела 5,14 ±0,38 Гликемия, мМ/л 2,58 ±0,18 4,80 ± 0,29 3,52 ± 0,36* 3,31 ± 0,32 3,71 ± 0,31* 5,40 ± 0,49* 6,53 ± 0,79 Примечание. Крыс наркотизировали диэтиловым эфиром и вводили подкожно ТА (2 мг/кг) или эквиобъемное количество 0,9% NaCl; через 4 дня животных забивали, определяли относительную массу лимфоидных органов и концентрацию глюкозы в сыворотке крови. Одна звездочка - различия достоверны между группами "контроль" и "стресс”; "контроль” и "контроль + ТА"; две звездочки - различия достоверны между группами "контроль + ТА" и "стресс + ТА". Статистическая обработка проведена с использованием критериев Стьюдента и Вилкоксона-Манна-Уитни; различия считали достоверными при р < 0,05. 25-. Влияние повторных эпизодов иммобилизационного стресса на толерантность к нагрузке глюкозой (4 г/кг). По оси ординат - концентрация глюкозы (в нМ/л). По оси абсцисс - время введения глюкозы животным контрольной (заштрихованные столбики) и экспериментальной (темные столбики) групп. Звездочка - р < 0,05 по сравнению с контролем. Оценку достоверности различий проводили с помощью критерия Стьюдента и точного критерия Фишера (л = 10 в каждой группе). Изучение содержания циркулирующих цитокинов выявило отсутствие значимого влияния анксиогенного стресса на концентрации ИЛ-1, ФИО, ИЛ-2 и ИЛ-12 (данные не представлены). Концентрация ИЛ-4, синтез которого стимулируется ГКГ [20], снижалась под влиянием анксиогенных иммобилизаций с 1.67 ±0,14 пг/мл в контроле (п = 12) до 1,10 ± 0,23 пг/мл (п = 10, р < 0,05/t). Уровень ИЛ-6 в сыворотке крови, наоборот, возрастал с 19,7 ± 0,5 пг/мл в контроле (п = 12) до 21,5 ± 0,9 пг/мл (и = 10, р < 0.05/С). Известно, что ИЛ-4 ограничивает тканевые эффекты ГКГ [13], а "эндокринный цитокин" ИЛ-6 активирует гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковую систему [6]. Возможно, нарастание концентрации циркулирующего ИЛ-6 на фоне снижения уровня ИЛ-4 направлено на компенсацию стрессогенного снижения чувствительности к ГКГ. Подобную компенсацию нельзя признать удовлетворительной, так как анксиогенный стресс вызывал увеличение толерантности крыс к глюкозе (см. рисунок), что отражает нарушение баланса между эффектами контринсулярных гормонов и инсулином в пользу последнего. Вместе с тем депрессогенное влияние стресса ограничивало постстрессорное нарастание толерантности к глюкозе. Это проявилось отрицательной корреляцией между исходным показателем исследовательского поведения стрессированных крыс и уровнем гликемии через 1 ч после введения глюкозы (гк- -0,48, р < 0,05). Аналогичная зависимость была выявлена между локомоцией стрессированных крыс и исходными (преднагрузочными) показателями гликемии (гк=-0,43, р < 0,05). Следует добавить, что в соответствии с правилом Вильдера-Лейтеса анксиогенный стресс вызывает гипергликемию на фоне изначально низкой концентрации глюкозы в крови (см. табл. 2) и не оказывает существенного влияния на этот параметр при относительно высоких исходных значениях гликемии (см. табл. 1). Обнаружение гипергликемизирующего эффекта анксиогенного стресса было связано с изучением ГКГ- чувствительности зимой, когда происходит "переключение с углеводного на липидный обмен" и наблюдается склонность к гипогликемии [9]. Связь между стрессогенными изменениями поведения и углеводного обмена особенно ярко проявилась после индукции аллоксанового диабета. Введение р-цитотоксического агента предварительно стрессированным крысам усугубляло поведенческую депрессию и потенцировало гипергликемизирующее действие аллоксана (см. табл. 1). При этом сама по себе инъекция аллоксана вызывала угнетение локомоции животных до уровня, сопоставимого с влиянием анксиогенного стресса. Следует отметить, что введение аллоксана контрольным и предварительно стрессированным крысам вызвало гибель примерно 1/3 животных в каждой группе, что обусловило равномерное сокращение выборок ко II серии тестирования в "открытом поле" (см. табл. 1). Для обсуждения вероятных причин отягощающего диабет действия стресса необходимо проанализировать отличия аллоксановой депрессии от анксиогенных расстройств поведения у крыс во II серии тестирования. Как видно из табл. 1, повторное тестирование контрольных крыс в "открытом поле" сопровождалось уменьшением их исследовательской, ориентировочной и двигательной активности. Такой феномен обычно трактуется как следствие габитуации, т. е. адаптации к условиям актографа [12]. Подобная трактовка неприменима к схеме эксперимента, использованной в данном исследовании. Это связано с амнезируюшим эффектом эфирного наркоза, на фоне которого проводились внутрибрюшинные инъекции сразу после I серии тестирования в "открытом поле". Кроме того, повторное исследование крыс в актографе было отделено от I серии большим промежутком времени. Скорее всего поведенческая депрессия во II серии тестирования может рассматриваться как следствие анксиогенного стресса, вызванного у контрольных крыс ингаляцией эфира и инъекцией 0,9% NaCl. Правомерность этого предположения иллюстрируется достоверным приростом анксиогенной дефекации во II серии тестирования по сравнению с I. Предварительная 4-кратная иммобилизация крыс обусловила увеличение ориентировочной реакции по сравнению со II серией контроля (см. табл. 1), что соответствует данным о "сверхбдительности" при тревожно-депрессивных состояниях [16]. Введение аллоксана, наоборот, вызывало снижение ориентировочной реакции, полностью подавляло поведение самоочистки (груминг) и уменьшало анксиоген- ную дефекацию по сравнению как с I серией тестирования, так и с показателями контроля II серии. Таким образом, аллоксан вызывает расстройства поведения, качественно противоположные последствиям анксиогенного стресса. Симптоматика такого рода отражает тяжесть локального воспалительного процесса [15] и в данном случае, по-видимому, связана с аллоксаниндуцированным инсулитом. Скорее всего инъекция р-цитотоксического агента на фоне предшествовавшего анксиогенного стресса вызывает более тяжелый ин- сулит, что обусловливает как усугубление поведенческих эффектов аллоксана, так и его гипергликемизирующее действие (см. табл. 1). Основой такой сенсибилизации к аллоксану может быть стрессогенное уменьшение чувствительности к ГКГ (см. табл. 2), противовоспалительная активность которых общеизвестна. Еще одной причиной отягощения аллоксанового инсулита может быть постстрессорный дефицит ИЛ-4, являющегося ан- тивоспалительным цитокином [20]. Не исключено также, что выраженный дефицит двигательной активности дополнительно ограничивает потребление глюкозы скелетной мускулатурой. Такая возможность иллюстрируется отрицательной экспоненциальной корреляцией (г = -0,7, р < 0,05) между локомоцией во II серии тестирования и уровнем гликемии у крыс с аллоксановым диабетом. Отдельного обсуждения заслуживают изменения церебральной активности МАО на фоне изученных воздействий (см. табл. 1). Введение аллоксана и анксиогенный стресс увеличивали активность фермента в нервной ткани. Предварительная 4-кратная иммобилизация потенцировала аллоксаниндуцированный прирост активности МАО в мозге При этом активность МАО в мозге крыс, получавших аллоксан после стресса, отрицательно коррелировала с двигательной активностью во II серии тестирования (гк = -0,67, р < 0,05). Данная зависимость позволяет рассматривать увеличение активности церебральной МАО как нейрохимическую основу поведенческой депрессии при изученных состояниях. Установленные факты касаются МАО-Б, определяемой использованным методом [12]. ГКГ стимулируют экспрессию МАО-Б в нервной ткани [14] и одновременно проявляют ингибиторный эффект в отношении предшествующих молекул фермента [18]. Возможно, выявленное нарастание активности МАО-Б в мозге связано с первоначальным стероидзависимьм усилением синтеза фермента и последующим ослаблением МАО-ингибиторного действия кортикостероидов из-за тахифи- лаксии к ГКГ. Не исключено, что увеличение церебральной активности МАО при аллоксановом диабете так же, как при ан- ксиогенном стрессе, отражает снижение ГКГ-чувствительности. По-видимому, такое снижение в первую очередь направлено на компенсацию дефицита инсулина за счет ограничения эффектов контринсулярных гормонов. Подобная ситуация в сочетании с увеличением активности МАО мозга, поведенческой депрессией, повышением инсулинчувствительности и устойчивости к гипоксии была продемонстрирована при ранее изученных диабет-протективных режимах стресса [2,10]. Следует отметить, что аллоксановый диабет тоже сопровождается нарастанием устойчивости к острой гипоксии [4] на фоне прироста церебральной активности МАО-Б и снижения поведенческой активности (см. табл. 1). Создается впечатление, что стрессорная профилактика аллоксанового диабета сводится к опережающей индукции компенсаторных процессов, разворачивающихся у контрольных крыс лишь при введении аллоксана. Анксиогенный режим иммобилизаций качественно не отличается от ранее изученных диабет-профилактических вариантов стресса по влиянию на чувствительность крыс к контринсулярным гормонам, активность МАО-Б в мозге животных и их локомоцию в "открытом поле” [2, 10]. Единственное отличие состоит в анксио- генном снижении устойчивости к гипоксии, что, по-видимому, обусловливает увеличение чувствительности к р-цитотоксическим воздействиям. Ранее было показано, что инъекции пропранолола, одновременно обладающего противотревожными и антигипокси- ческими свойствами, резко увеличивают устойчивость стрессированных крыс к гипергликемизирующему действию аллоксана [2]. Возможно, включение анксиолитической терапии в схему лечения инсулинзависимого сахарного диабета приведет к снижению темпа деструкции резидуальных р-клеток за счет увеличения устойчивости к гипоксии. Первоначальный клинический опыт [3] свидетельствует о перспективности такого подхода. Выводы 1. Четырехкратная иммобилизация крыс вызывает снижение переносимости острой гипоксии на фоне анксиогенных расстройств поведения, которые сопровождаются признаками пониженной чувствительности к глюкокортикоидам (устойчивостью к тимус-гипоплазируюшему эффекту триамцинолона ацетонида, нарастанием толерантности к нагрузке глюкозой, уменьшением концентрации ЙЛ-4 в сыворотке крови, увеличением церебральной активности МАО-Б). 2. Одновременно с развитием гипергликемии при аллоксановом диабете у крыс наблюдается поведенческая депрессия, сопровождающаяся нарастанием активности МАО-Б в ткани головного мозга. 3. Предшествующий анксиогенный стресс усугубляет аллоксаниндуцированный прирост церебральной активности МАО-Б и сопутствующие нарушения поведения крыс, а также потенцирует гипергликемизирующий эффект аллоксана.