Роль аполипопротеина A-I в реализации анаболического действия стероидных гормонов

Считается, что стероидные гормоны в сыворотке крови переносятся с помощью специального белка - транскортина [10]. Попадая в клетки органов-мишеней, они взаимодействуют со специфическими внутриклеточными рецепторами, транспортируются в ядра, где и усиливают экспрессию определенных генов [3]. Однако было показано, что часть стероидных гормонов связывается и транспортируется липопротеинами крови [4]. К ним прежде всего следует отнести липопротеины высокой плотности (ЛПВП). Показано, что Кжс стероидных гормонов с ЛПВП составляет (2,0 ± 0,2) • 106 М~’ [8]. Стероидные гормоны вместе с ЛПВП захватываются резидентными макрофагами печени (клетки Купфера) с помощью рецепторопосредованного эндо- цитоза. Стимулированные липополисахаридами (ЛПС) макрофаги особенно активно захватывают ЛПВП3 [8]. Во вторичных лизосомах ЛПВП подвергаются дезинтеграции с образованием аполипопротеина А-1 (апоА-I), а стероидные гормоны восстанавливают А4, 3-кетогруппировку при участии 5а- и 5р-редуктаз с образованием тетрагидросоединений [18]. Образовавшийся комплекс тетрагидрокортизол-апоА-1 попадает в интерстициальное пространство, захватывается соматическими клетками (гепатоцитами), переносится в ядро и участвует в усилении экспрессии генов [6, 8]. Результатами последних исследований показано, что во фракции кислых негистоновых белков, полученных из ядер клеток различных тканей, присутствует 2 белка с апоА-1-иммуно- реактивностью [7]. Один белок с мол. массой 28 кД присутствует в транскрипционно активном хроматине и ядерном матриксе, другой - с мол. массой около 14 кД - в транскрипционно неактивном хроматине [5]. Первый белок соответствует сывороточному апоА-1, второй, вероятно, является продуктом его лимитированного протеолиза. В данной работе предпринята попытка показать роль комплекса некоторых стероидных гормонов с апоА-I в реализации анаболического действия этих стероидных гормонов. Материалы и методы Исследования проведены на культуре гепатоцитов и совместной культуре гепатоцитов и клеток Купфера, изолированных из печени крыс-самцов Вистар массой 180-200 г. Изолированные клетки печени получали ферментативным способом по методу М. Berry и D. Friend [13] в нашей модификации [11], проводя рециркуляционную перфузию органа 0,03% раствором коллагеназы ("Sigma", США). После диссоциации ткани гепатоциты отделяли от непаренхиматозных клеток с помощью дифференциального центрифугирования. Непаренхиматозные клетки фракционировали в элютриаторном роторе JE-6 на центрифуге J2-21 ("Beckman", США) при скорости вращения ротора 623g. Для отмывки купферовских и эндотелиальных клеток использовали скорость прокачивания буфера 22 и 42 мл/мин соответственно [16]. Жизнеспособность клеток оценивали методом исключения трипанового синего, а чистоту клеточных фракций - с помощью световой и электронной микроскопии. Полученные клетки ресуспендировали в среде RPMI-1640 pH 7,4, содержащей 15 мМ HEPES, 5% сыворотки крупного рогатого скота, 2 мМ глутамина и 50 мкг/мл гентамицина. Для ин- кубации клеток использовали 24-луночные планшеты ("Linbro", США), предварительно покрытые коллагеном. Клетки инкубировали в СО2-инкубаторе в атмосфере СО2 (5%) и О2 (95%) при 37°С в среде, содержащей гормоны в концентрации 10“ъ М, ЛПВП - 100 мкг/мл, апоА-1 - 100 мкг/мл. Для стимуляции макрофагов использовали ЛПС, полученный из Serratia marces- cens ("Sigma", США). Каждые 24 ч инкубации проводили смену среды на идентичную. Для измерения скорости биосинтеза белка в культуру клеток за 2 ч до окончания инкубации добавляли 37 кБк/мл [|4С]-лейцина (Чехия). Для измерения скорости синтеза ДНК в культуру клеток за 20 ч до окончания инкубации добавляли 37 кБк/мл [3Н]-тимидина ("Нуклон", Москва). Часть содержимого лунки переносили на мембранные фильтры для определения связанной с белком или с ДНК радиоактивности. Радиоактивность проб измеряли в жидкостном сцинтилляционном счетчике ("Mark-IH". США). Для расчета удельной радиоактивности белок определяли по методу О. Lowry [17] и выражали в имп/мин на 1 мг белка, ДНК - по методу Burton [14] и выражали в имп/мин на 1 мкг ДНК. Гормоны для исследования подбирали таким образом, чтобы Д4, 3-кетогруппа в A-кольце была восстановленной. Этим требованиям соответствовали такие гормоны, как андростерон, дегидроэпиандростерон, тетрагидрокортизол. Кроме того, использовали также сульфатированную форму дегидроэпиандростерона, в которой гидроксил в СЗ-положении заменен на остаток серной кислоты. В этом случае активная гидроксильная группа была связана не с углеродным атомом кольца А, а с атомом серы (см. рисунок). Предполагалось, что ОН-группа гормонов в СЗ-положе- нии может конкурентно участвовать в образовании водородных связей с азотистыми основаниями ДНК, приводя к разрыву последних в комплементарных парах ГЦ-типа [6]. Данный механизм может рассматриваться как фактор инициации транскрипции. В работе использовали дегидроэпиандростерон ("Amersham", Англия) и дегидроэпиандростерона сульфат ("Sigma", США). Андростерон и тетрагидрокортизол были любезно предоставлены акад. РАМН Ю. А. Панковым. Препаративное выделение ЛПВП из сыворотки крови осуществляли с помощью изоплотностного ультрацентрифугирования в растворе КВг [15] в роторе 75 Ti на ультрацентрифуге L5- 75 ("Beckman", США). Делипидирование ЛПВП проводили охлажденной до -16°С смесью хлороформ-метанол (2:1) с последующей многократной отмывкой эфиром. АпоА-1 получали методом гель-фильтрации на сефарозе 4В ("Pharmacia", Швеция) в 0,01 М трис-НС1-буфере pH 8,6, содержащем 6 М мочевину. Пик 2, соответствующий апоА-1, повторно очищали путем ионообменной хроматографии на DEAE-Toyopearl 650 М (TSK, Япония), уравновешенной 0,01 М трис-НС1 pH 8,6, с 6 М мочевиной. Элюирование проводили исходным буфером с линейным градиентом от 0,01 до 0,5 М NaCl. Достоверность полученных данных оценивали с помощью t- критерия Стьюдента при уровне значимости р < 0,05. Результаты и их обсуждение Андростерон является метаболитом мужских половых гормонов - тестостерона и андростендиона - и относится к анаболикам. Андрогенная активность его составляет 10% активности тестостерона. Принципиальное отличие его от тестостерона - это восстановления А4, 3-кетогруппировка в A-кольце. Дегидроэпиандростерон - гормон сетчатой зоны коры надпочечников, секретируемый в сульфатированной форме. Десульфатирование дегидроэпиандростерона происходит в резидентных макрофагах, главным образом в клетках Купфера. Гормон оказывает выраженное анаболическое действие. Тетрагидрокортизол является метаболитом кортизола и считается метаболически неактивным продуктом его деградации [12]. Существенное отличие от последнего - восстановленная Д4, 3-кетогруппировка в A-кольце гормона. Процесс восстановления протекает в макрофагах и связан с активностью 5а- и 5р-редуктаз [18]. Ранее было показано, что стероидные гормоны легко взаимодействуют с липопротеинами крови, в первую очередь с ЛПВП [4]. Белком, с которым идет комплексообразование, является апоА-I. Касс составляет (0,4 ± 0,1)- 106 М_| [2]. Это несколько ниже, чем Касс гормонов с ЛПВП, что, вероятно, связано с некоторыми структурными изменениями аполипопротеинов при делипидировании ЛПВП. Проведенные исследования показали, что стероидные гормоны с анаболическим действием не изменяли скорости биосинтеза белка в первичной культуре гепатоцитов (табл. 1). Исключение составлял дегидроэпиандростерон, который достоверно увеличивал скорость включения меченного [14С]-лейцина в белок. Присутствие в среде инкубации апоА-I достоверно снижало включение метки в белок, что, вероятно, обусловлено неспецифическим связыванием [,4С]-лейцина с апоА-I. Добавление в среду инкубации анаболиков совместно с апоА-I во всех случаях увеличивало скорость биосинтеза белка. Последняя прогрессивно возрастала в ряду андростерон -> дегидроэпиандростерон -» тетрагидрокортизол -> дегидроэпиандростерона сульфат. Полученные результаты позволяют сделать заключение о том, что для проявления анаболического действия гормонов необходим комплекс их с апоА-I. В проявлении данного эффекта важную роль играет восстановление Д4, 3-кетогруппировки А- кольца. В исследованиях, проведенных ранее, было показано, что кортизол не оказывал влияния на биосинтез белка [6]. По результатам данного эксперимента, высокой активностью обладал тетрагидрокортизол - гормон, в котором ОН-группа в СЗ- положении находилась в транс-, а водород у С5-атома - в цисположении. Наибольшая активность обнаружена у дегидроэпиандростерона сульфата, у которого ОН-группа в СЗ-положении связана с атомом серы. Увеличение биосинтеза белка под влиянием анаболических стероидов, несомненно, связано с усилением внутриклеточной регенерации [9]. Однако оно имеет отношение и к пролиферации клеток. Известно, что усиление биосинтеза белка предшествует усилению синтеза ДНК в клеточном цикле [1]. Учитывая это обстоятельство, было проведено изучение влияния анаболических стероидов на скорость включения [3Н]-тимидина в ДНК гепатоцитов. Проведенные исследования показали, что общая картина изменений соответствует вышеописанной, но в количественном отношении менее выражена (табл. 2). В суточной культуре гепатоцитов добавление стероидных гормонов даже несколько снижало скорость синтеза ДНК. При этом добавление анаболических стероидов в среду инкубации совместно с Таблица 1 Влияние различных гормонов и апоА-I на скорость биосинтеза белка в культуре гепатоцитов (М ± т; п = 6) Условия инкубации Включение [|4С]-лейцина в белок, имп/мин на 1 мг белка без апоА-1 в присутствии апоА-1 Контроль 6841 ± 393 3 474 ± 189** Андростерон 6084 ± 365 4 338 ± 310* ** Дегидроэпиандростерон 8973 ± 415* 5 787 ± 570*-** Дегидроэпиандростерона сульфат 7668 ± 559 16 938 ± 1341* ** Тетра гидрокортизол 6228 ± 390 9 898 ± 972* ** Примечание. Здесь и в табл. 2: звездочки - достоверность (р < 0,05) различий: одна - с контролем внутри группы, две - между группами. Таблица 2 Влияние различных гормонов и апоА-I на скорость синтеза ДНК в культуре гепатоцитов (М ± т; п = 6) Условия инкубации Включение [3Н]-тимидина в ДНК, имп/мин на 1 мкг ДНК без апоА-1 в присутствии апоА-1 Контроль 212 ± 8 158 ± 22** Андростерон 177 ± 9* 200 ± 20 Дегидроэпиандростерон 205 ± 6 160 ± 8** Дегидроэпиандростерона сульфат 158 + 13* 234 ± 5* ** Тетрагидрокортизол 159 + 15* 235 ± 5*-** Таблица 3 Влияние кортизола, ЛПВП и ЛПС на скорость биосинтеза белка в культуре гепатоцитов и сокультуре гепатоцитов и макрофагов в различные сроки (М ± т; п = 6) Условия инкубации Включение 14С]-лейцина в белок, имп/мин на 1 мг белка гепатоциты гепатоциты + макрофаги 1 -е сутки 3-и сутки 1 -е сутки 3-и сутки Контроль 6900 ± 510 6790 ± 450 7570 + 310 7 520 ± 430 ЛПВП 6570 ± 420 6440 + 210 6270 + 500* 6 490 ± 560 ЛПВП + ЛПС ЛПВП + 6950 ± 540 6730 ± 290 7220 ±410 7 390 + 520 кортизол 6370 ± 320 6470 ± 400 6010 ± 470* 5880 ± 330* ЛПВП + кортизол + ЛПС 4880 ± 270* 4390 ± 190*9770 ± 630* 12 920 ± 570*'** Примечание. Здесь и в табл. 4: звездочки - достоверность (р < 0,05) различий: одна - с контролем, две - между сутками. апоА-I оказывало иное действие. В суточной культуре андростерон и дегидроэпиандростерон не влияли на синтез ДНК, тогда как дегидроэпиандростерона сульфат и тетрагидрокортизол достоверно его увеличивали. Таким образом, проведенные исследования позволяют предположить, что один и тот же механизм лежит в основе как внутриклеточной регенерации, так и клеточной пролиферации. Известно, что гепатоциты не содержат 5а- и 5[3-редуктаз, поэтому восстановление А4, 3-кетогруппировки стероидов является исключительно привилегией макрофагов. С целью изучения роли процессов восстановления А4, 3-кетогруппировки в механизме анаболического действия гормонов мы использовали одновременно первичную культуру гепатоцитов и сокультуру их с макрофагами. В этом случае для изучения анаболического эффекта в среду инкубации добавляли ЛПВП - источник апоА-1 и кортизол - источник восстановленной формы гормона тетрагидрокортизола. Для усиления активного захвата ЛПВП и гормона макрофаги стимулировали добавлением ЛПС. Проведенные исследования показали, что в первичной культуре гепатоцитов скорость биосинтеза белка в течение первых 3 сут не изменялась (табл. 3). Добавление в среду инкубации ЛПВП, ЛПВП и ЛПС или ЛПВП и кортизола не изменяло скорость биосинтеза белка. Одновременное добавление в среду инкубации ЛПВП, кортизола и ЛПС даже несколько снижало ее, что, вероятно, обусловлено неспецифическим связыванием [|4С]- лейцина. В сокультуре гепатоцитов и макрофагов как в 1-е, так и на 3-и сутки инкубации не наблюдалось усиления биосинтеза белка при добавлении ЛПВП, ЛПВП и ЛПС, ЛПВП и кортизола. В ряде случаев отмечено даже некоторое снижение. Однако одновременное добавление в среду инкубации ЛПВП, кортизола и ЛПС приводило к достоверному увеличению биосин- Таблица 4 Влияние кортизола, ЛПВП и ЛПС на скорость синтеза ДНК в культуре гепатоцитов и сокультуре гепатоцитов и макрофагов в различные сроки (М ± т; л = 6) Условия ин- кубации Включение [3Н]-тимидина в ДНК, имп/мин на 1 мкг ДНК гепатоциты гепатоциты + макрофаги 1 -е сутки 3-и сутки 1-е сутки | 3-и сутки Контроль 200 ± 17 170 ± 11 202 ± 13 105 ± 10** ЛПВП 187 ± 13 163 ± 14 140 ± 11* 103 ± 8** ЛПВП + ЛПС 173 ± 15 157 ± 14 191 ± 8 116 ± 15** ЛПВП + кортизол 171 ± 13 158 ± 10 208 + 10 121 ± 7** ЛПВП + кортизол + ЛПС 130 ± 12* 149 ± 12 186 ± 13 132 ± 9* ** теза белка в 1-е сутки и к еще более значительному увеличению на 3-и сутки инкубации (см. табл. 3). Аналогичная ситуация складывалась при анализе влияния тех же добавок на скорость включения [3Н]-тимидина в ДНК (табл. 4). В первичной культуре гепатоцитов никакие добавки не оказывали влияния на скорость синтеза ДНК. В случае одновременного добавления ЛПВП, кортизола и ЛПС отмечали даже достоверное снижение скорости в 1-е сутки. Увеличение продолжительности инкубации также снижало скорость синтеза ДНК в культуре, не содержащей добавок В сокультуре гепатоцитов и макрофагов общая картина изменений сохранялась. Однако одновременное добавление в среду инкубации ЛПВП, кортизола и ЛПС приводило к достоверному увеличению синтеза ДНК на 3-и сутки инкубации. Полученные результаты позволяют сделать заключение о том, что макрофаги занимают ключевые позиции в реализации анаболического действия стероидных гормонов в связи с уникальной способностью восстанавливать А4, 3-кетогруппировку стероидных гормонов. Заключение Таким образом, в данной модели анаболический эффект стероидных гормонов проявляется только в том случае, если они входят в состав комплекса с апоА-I. В механизме анаболического действия стероидных гормонов важную роль играет восстановление А4, 3-кетогруппировки A-кольца гормонов. Процесс восстановления тесно связан с активностью резидентных макрофагов, которая значительно усиливается под влиянием ЛПС. Описанный механизм лежит в основе анаболического действия как андрогенов, так и стероидных гормонов коры надпочечников. Наиболее активным анаболиком является сульфатированная форма дегидроэпиандростерона. Тетрагидрокортизол, имеющий ОН-группу у СЗ-атома в транс-позиции, а водород у С5-атома в цис-позиции, является метаболически активным гормоном, усиливающим скорость биосинтеза как белка, так и ДНК.