Нейроэндокринные механизмы развития экспериментальной ановуляции гиперандрогенного происхождения

Несмотря на неоспоримые успехи, достигнутые в последние годы в лечении ановуляторного бесплодия (АБ), связанные, в частности, с применением вспомогательных репродуктивных технологий, проблема поиска новых методов и средств лечения заболевания по-прежнему остается актуальной. В патогенезе АБ важную роль играет так называемый андрогенный фактор. Гиперандрогенные состояния у женщин, как правило, сопровождаются хронической ановуляцией. Удельный вес бесплодия гиперандрогенного генеза в структуре женской инфертильности составляет более 20% [3, 8]. Гиперандрогения в женском организме чаще всего является следствием повышенной секреции андрогенов яичниками (синдром поликистозных яичников) или надпочечными железами (андрогенитальный синдром). Применяемые в настоящее время методы лечения АБ предусматривают применение гормональных препаратов (кломифен, гонадотропины и др.) [4, 5]. Указанные индукторы овуляции, однако, оказываются малоэффективными в случаях значительной гиперандрогении, так как они не способны угнетать чрезмерную продукцию андрогенов яичниками и(или) корой надпочечников. В последние годы в литературе появился ряд сообщений об использовании для лечения гиперандрогенизации у женщин, одним из проявлений которой является гирсутизм, антиандрогенных препаратов, таких как флутамид, ципротерона ацетат, кетоконазол, финастерид [10, 13, 14]. Отмечается положительный эффект некоторых из упомянутых препаратов в отношении уменьшения роста волос [6, 9], однако сведений о воздействии антиандрогенов на фертильность не приводится. Цель настоящего исследования заключалась, во-первых, в создании экспериментальной модели АБ "гиперандрогенного" происхождения и изучении нейроэндокринных механизмов его развития и, во-вторых, в экспериментальной проверке возможности использования блокатора клеточных рецепторов андрогенов флутамида для восстановления овуляторных циклов и фертильной способности. Материалы и методы Исследования выполнены на половозрелых самках крыс линии Вистар, у которых АБ развивалось в результате имплантации под кожу шеи силастиковых капсул, содержащих 5 мг кристаллического тестостерона (Т). Имплантацию проводили в стадии метэструса. Контрольная группа была представлена ложно- оперированными самками. Начиная со следующего после имплантации дня, ежедневно проводили микроскопическое изучение вагинальных мазков. Через 2 нед после подсадки капсул часть контрольных и подопытных животных декапитировали. Матку и яичники взвешивали, яичники фиксировали в жидкости Буэна для последующего гистологического исследования. Гипоталамус (для изучения метаболизма Т) извлекали на холоду и хранили до проведения анализа при -20°С. В плазме крови определяли содержание Т и биологически активного Л Г (биоЛГ). Часть животных с АБ получали ежедневно в течение 10 дней флутамид (нифтолид. Украина) в дозе 10 мг/кг массы тела (перорально, через желудочный зонд, в виде суспензии на карбоксиметилцеллюлозной основе), после чего половину самок декапитировали и отбирали материал для дальнейших исследований (см. выше), а другую половину использовали для изучения плодовитости. Для этого самок с АБ. которые получали или не получали (группа сравнения) флутамид, подсаживали к сексуально активным самцам. Антиандроген самкам продолжали вводить до появления сперматозоидов в вагинальных мазках. Изучали следующие характеристики плодовитости: осеменяемость, количество развившихся беременностей, количество и качество приплода. Кроме того, у контрольных самок и самок с АБ, которые получали или не получали флутамид, изучали реактивность гипофиза в ответ на введение экзогенного ЛГ-рилизинг-гормона (ЛГ-РГ). Для этого за 1 сут до проведения эксперимента животным под легким эфирным наркозом имплантировали в наружную яремную вену силастиковый катетер [11]. В день эксперимента животным через катетер вводили препарат свиного ЛГ-РГ ("Serva”, Германия) в дозе 25 нг в 250 мкл изотонического раствора натрия хлорида. Кровь для определения содержания биоЛГ в плазме брали порциями по 0,5 мл до и через 10, 20 и 30 мин после введения препарата с немедленным замещением соответствующим объемом гепаринизированного изотонического раствора. Содержание Т в плазме крови определяли радиоиммуноло- гическим методом с использованием [1,2-3Н]-Т с удельной активностью 1,7 ТБк/моль ("Изотоп", Россия) и антисыворотки к Т, полученной при иммунизации кроликов конъюгатом З-О- карбоксиметилоксим-Т с БСА ("Sigma", США). Содержание биоЛГ определяли модифицированным методом М. van Damme и соавт. [5, 7] с использованием суспензии интерстициальных клеток семенников мыши и стандарта ЛГ из гипофиза человека ("Sigma", США), калиброванного по 1-му международному стандарту 68/40. Метаболизм Т в гипоталамусе изучали путем инкубации надосадочной фракции после центрифугирования при 1000 g 10% гомогената ткани гипоталамуса с [ 1,2,6,7-3Н]-Т ("Amersham", Англия) в присутствии НАД • Н с последующим разделением образовавшихся метаболитов двухмерной хроматографией в тонком слое силикагеля [2]. После радиометрии элюатов из участков хроматограммы, соответствовавших эстрадиолу- 17р, 5а-дигидротестостерону (ДГТ) и 5а-андростан-3а, 17р-диолу (За-диол), рассчитывали активность ферментов ме- Табл и ца 1 Содержание биоЛГ в плазме крови и масса органов репродуктивной системы у самок крыс с АБ гиперандрогенного происхождения (Л/ ± т; п = 6) Группа животных Содержание биоЛГ, МЕ/л Относительная масса, мг/100 г массы тела яичники матка Интактные 3,72 ± 0,21 37,6 ± 2,0 273,5 ± 31,9 АБ 4,93 ± 0,53* 24,3 ± 3,5* 126,7 ± 4,8* АБ + флутамид 3,85 ± 0,22 41,7 ± 6,6 176,0 ± 16,1* Примечание. * - р < 0,05 по сравнению с контрольной группой. Рис. 1. Гистологическая структура яичников. а - интактных крыс; б - крыс с АБ; в - крыс с АБ, получавших флутамид. Окраска гематоксилином и эозином. Об. 2,5, ок. 3,3. таболизма Т. Ароматазную активность выражали в пикомолях эстрадиола-170, образовавшегося в течение 1 ч, а 5а-редуктазу - как сумму образовавшихся 5а-восстановленных метаболитов (ДГТ и За-диол) в пересчете на 1 г ткани или 1 г белка. Концентрацию белка в инкубатах определяли методом Лоури. Статистическую обработку результатов исследования проводили с использованием критерия t Стьюдента. Результаты и их обсуждение Развившаяся в результате имплантации половозрелым самкам крыс капсул с Т гиперандрогенемия (содержание Т в плазме Рис. 2. Метаболизм Т в гипоталамусе самок с АБ гиперандрогенного происхождения при экспериментальной антиандро- генной терапии. а - ароматазная активность (в пмоль эстрадиола/ч/г белка); б - 5а-редуктазная активность (в нмоль (ДГТ + За-диол)/ч/г белка). Светлые столбики - интактные самки; столбики с косой штриховкой - самки с АБ; темные столбики - самки с АБ, получавшие флутамид (10 мг/кг). * - р < 0,05 по сравнению с интактными животными. крови 14,2 ± 1,1 нмоль/л против 1,5 ± 0,2 нмоль/л у животных контрольной группы) приводила к нарушению астральных циклов по типу персистентного эструса или диэструса у 80% животных; у остальных 20% крыс астральные циклы были нерегулярными с удлинением фазы диэструса. Содержание биоЛГ в крови самок с АБ достоверно повышалось, масса яичников и матки снижалась (табл. 1). Отсутствие свежих желтых тел, истончение фолликулярного эпителия и гипертрофия клеток theca interna, выявленные при микроскопическом исследовании, свидетельствовали о блокаде овуляций (рис. 1). Реакция гипофиза на стимуляцию экзогенным гонадолиберином была ослаблена и составила 30% от реакции интактных самок (табл. 2). Кроме того, в гипоталамусе самок с АБ достоверно интенсифицировался процесс ароматизации Т (рис. 2). Приведенные характеристики ановуляторного состояния у экспериментальных животных весьма сходны с наблюдаемыми в клинике изменениями гипоталамо-гипофизарно-яичниковой системы при синдроме поликистозных яичников. Следует отметить, что применявшиеся ранее для моделирования ановуляторного состояния экспериментальные подходы либо не отражают адекватно изменения, наблюдающиеся при синдроме поликистозных яичников (неонатальная андрогенизация), либо не приводят к гиперандрогенизации (деафферентация медиобазального гипоталамуса, пересадка яичников в среду с пониженной температурой, постоянное освещение и т. д.). Изменение чувствительности гипофиза к гонадолиберину у крыс с АБ, по-видимому, является одной из основных причин ановуляции, вызванной избытком андрогенов. Уровень секреции J1Г у таких животных хоть и повышен, однако недостаточен для наступления овуляции. Нарушения функционального метаболизма Т в гипоталамусе также являются патогенетическим фактором развития ановуляции: обнаруженное нами усиление в 1,5 раза образования 5а-восстановленных метаболитов Т в гипоталамусе может вызывать изменения регуляторных механизмов секреции гонадотропинов. Данный вывод согласуется с наблюдениями D. Loke и соавт. [12] об ослаблении реакции гипофиза на гонадолиберин у самок крыс при имплантации дигидротестостерона в гипоталамус. Усиление ароматизации Т в гипоталамусе крыс с АБ и, следовательно, локальное повышение концентрации эстрадиола в гипоталамусе, очевидно, является причиной увеличения в конечном итоге уровня ЛГ в крови. Экспериментальная терапия АБ с помощью флутамида привела к прерыванию персистентного эструса или диэструса. Структура астральных циклов в некоторой степени оставалась все же нарушенной, с удлинением фазы межтечки. При морфологическом исследовании яичников найдены свежие желтые тела, что свидетельствовало о наступлении овуляции. Уровень Т в крови у этих самок несколько снижался (до 8,75 ± 0,60 нмоль/л), однако оставался достоверно более высоким, чем у интактных животных. Это снижение можно объяснить активацией флута- мидом ферментных систем печени, ответственных за метаболическую деградацию Т [1]. Под воздействием флутамида полностью восстанавливалась масса яичников, снижался до нормального уровень биоЛГ в крови (см. табл. 1) и нормализовался процесс ароматизации Т в гипоталамусе (см. рис. 2). Процесс 5а- восстановления Т, напротив, интенсифицировался под воздействием антиандрогена. У самок с АБ, получавших флутамид, изменялась динамика реакции гипофиза на введение ЛГ-РГ: она приобретала торпидный характер, но в целом восстановления реактивности гипофиза не происходило (см. табл. 2). С нашими экспериментальными наблюдениями в некоторой степени коррелируют клинические наблюдения М. Marugo и соавт. [13] об отсутствии модификации реактивности гипофиза к ЛГ-РГ под воздействием применения флутамида в течение 1 мес у больных с идиопатическим гирсутизмом, у которых она была исходно ослаблена. Изучение плодовитости самок с АБ, получавших флутамид с целью преодоления андрогенного "блока", дало обнадеживающие результаты. У 80% осемененных самок с АБ антиандроген- ная терапия привела к восстановлению фертильности, при этом сперматозоиды были обнаружены в вагинальных мазках у 100% самок. Для сравнения в группе животных с АБ сперматозоиды найдены в мазках 75% самок, что указывает на снижение половой рецептивности; беременность не развилась ни у одной из них. Следует отметить, что силастиковые капсулы, содержащие Т, оставались в теле животных на протяжении всей беременности. Количество крысят в приплоде (в средне.м 9,25 ± 0,77 на 1 самку) не отличалось от нормы (9,20 ± 0,81). Родившиеся крысята не имели видимых физических недостатков и отклонений в развитии. Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о целесообразности клинической проверки эффективности флутамида для нейтрализации неблагоприятного андрогенного фона при терапии АБ гиперандрогенного происхождения. Выводы 1. Повышение уровня Т в крови половозрелых самок крыс после подкожной имплантации силастиковых капсул, содержащих Т, вызывает ановуляцию. 2. Полученные данные о нарушении функционального метаболизма андрогенов в гипоталамусе, снижении чувствительности гипофиза к люлиберину, изменение структуры эстраль- ных циклов, поликистозных изменениях в яичниках свидетельствуют о нейроэндокринном генезе нарушений овуляции у крыс с экзогенной гиперандрогенемией. 3. Использование флутамида в качестве средства экспериментальной антиандрогенной терапии привело к частичной нормализации гормональных, биохимических и морфологических характеристик репродуктивной системы, а также к восстановлению фертильности у самок с АБ гиперандрогенного происхождения. Таблица 2 Реакция гипофиза на введение ЛГ-РГ у самок крыс с АБ гиперандрогенного происхождения (М ± т; п = 6) Группа животных БиоЛГ, МЕ/л Максимальный при- рост Л Г 0 мин 10 мин 20 мин 30 мин Интактные 3,72 ± 0,21 17,15 ± 1,43** 8,61 ± 0,51** 3,88 ± 0,22 13,42 ± 1,28 Интактные + флутамид 3,82 ± 0,26 15,41 ± 1,26** 7,81 ± 0,65** 4,34 ± 0,23 11,59 ± 1,12 АБ 4,92 ± 0,53* 5,41 ± 0,17* 8,33 ± 0,73** 5,67 ± 0,68* 3,40 ± 0,42 АБ + флутамид 3,85 ± 0,22 3,89 ± 0,34* 4,11 ± 0,33* 4,57 ± 0,32 0,72 ± 0,39 Примечание. * - р < 0,05 по сравнению с соответствующей группой интактных животных; ** - р < 0,05 по сравнению с исходным уровнем.