Влияние хронического введения нейропептида Y на состояние B и а-клеток островков Лангерганса у интактных и диабетических крыс

Нейропептид Y (NPY) впервые был выделен К. Tatemoto [18] в 1982 г. из мозга лягушек. Последующие исследования показали, что он широко распространен в структурах центральной и периферической нервной системы [11]. В головном мозге наибольшая плотность нейронов и нервных волокон, содержащих NPY, выявлена в гипоталамусе [11]. В последнее время внимание исследователей привлекают внегипоталамические источники синтеза NPY. Доказана способность синтеза NPY р-, Д[10] и ос-клетками [19] панкреатических островков.

В экспериментах на перфузируемой поджелудочной железе [12] и интактных наркотизированных крысах [9, 15] показано, что однократное введение NPY изменяет секрецию инсулина и глюкагона. Кроме того, у животных с экспериментальным диабетом I и II типа наблюдается увеличение синтеза NPY в гипоталамических ядрах, являющихся центрами координации углеводного и энергетического метаболизма [7].

Приведенные данные позволяют предположить, что один из возможных биологических эффектов NPY состоит в способности влиять на функцию островков Лангерганса и гомеостаз глюкозы.

В связи с вышеизложенным целью работы было изучение влияния хронического центрального и периферического введения NPY на состояние ри ос-клеток у интактных и диабетических животных с учетом их возможных паракринных взаимоотношений.

Материалы и методы

Исследование проведено на 85 крысах линии Вистар массой 250—270 г. Животные были разделены на 6 экспериментальных групп (см. таблицу): 1-я группа — интактные, 2-я — нормальные с периферическим введением NPY, 3-я — нормальные с центральным введением NPY, 4-я — крысы с экспериментальным диабетом I типа, 5-я — диабетические крысы с периферическим введением NPY, 6-я — диабетические крысы с центральным введением NPY. Сахарный диабет моделировали однократным введением стрептозотоцина ("Sigma Chemical’’, США) в дозе 50 мг/кг в 0,5 мл 0,1 М цитратного буфера (pH 4,5) внутрибрюшинно [1]. NPY вводили ежедневно в течение 10 дней. Для центрального (интрацеребровентрикулярного) введения пептида в дозе 10 нг в 3 мкл 0,9% раствора NaCl животным предварительно имплантировали стальную канюлю (калибр G27) в правый латеральный желудочек мозга по координатам АР = 9,5 мм; L = 1,5 мм; Н = 4,5 мм [14]. На 8-й день после операции животным 6-й группы моделировали диабет. Крысам 6-й груп-

Влияние хронического интрацеребровентрикулярного и интраперитонеального введения NPY интактным и диабетическим крысам на морфофункциональные показатели островков Лангерганса, концентрацию инсулина и глюкозы в плазме крови

Примечание. Звездочки — достоверность различий с группой интактных животных: одна — прир < 0,05; две — при р < 0,001.

пы NPY вводили с 26-го по 35-й день течения патологического процесса, а крысам 3-й группы — с 33-го дня после имплантации канюли. Периферическое введение NPY осуществляли интраперитонеально в дозе 2,5 мкг в 0,5 мл 0,9% раствора NaCl в те же временное сроки. Дополнительным группам нормальных и диабетических животных, которые служили контролем, в течение 10 дней интраперитонеально и интрацеребровентрикулярно вводили аналогичные количества 0,9% раствора NaCl.

Через 24 ч после последнего введения пептида или физиологического раствора на фоне 16-часового голодания животных декапитировали под этаминаловым наркозом (40 мг/кг), отбирали кровь для определения концентрации глюкозы и инсулина, извлекали поджелудочную железу, которую фиксировали в жидкости Буэна и после стандартной гистологической обработки заливали в парафин.

Определение уровня инсулина и глюкагона в серийных срезах поджелудочной железы толщиной 5 мкм проводили методом непрямой иммунофлюоресценции.

Для выявления концентрации инсулина использовали набор фирмы ’’Peninsula Laboratories Inc.” (США). Количественное определение инсулина в островках проводили с помощью компьютерной системы цифрового анализа изображения VIDAS-386 (’’Kontron Elektronik", Германия), сопряженной посредством высокочувствительной видеокамеры COHU 4722 ("COHU Inc.”, США) с микроскопом "Axioscop” ("Zeiss”, Германия). Определяли следующие параметры: площадь островка Лангерганса (в мкм²), площадь материала, иммунореактивного к инсулину (в мкм²), а также его концентрацию и содержание в островках (в условных микроединицах — мкЕ), вычисляемое как произведение площади иммунореактивного материала на концентрацию инсулина.

Для определения уровня глюкагона в качестве первичных антител использовали мышиные моноклональные антитела к глюкагону ("Sigma"), а в качестве вторичных — козьи IgG против Ig мыши, конъюгированные с FITC ("Sigma”). Количественное определение содержания глюкагона в осклетках проводили в ультрафиолетовом спектре возбуждения 390—420 нм на компьютерной цитофлюориметрической системе ЛЮМАМ-И2 (ЛОМО, Россия) по ранее описанной методике [4]. В каждой экспериментальной группе исследовали 80—100 островков Лангерганса в серийных срезах из различных отделов поджелудочной железы. Регистрировали количество ос-клеток в каждом островке и содержание гормона в каждой из них, пропорциональное интенсивности флюоресценции (в мкЕ). Определение концентрации инсулина в крови проводили радиоиммунологическим методом с использованием коммерческого набора РИО-ИНС-ПГ-¹²⁵! (Беларусь), а глюкозы в крови — глюкозооксидазным методом с помощью набора "Диаком Глюкоза ГО" (ДИАКОМСИНТЭКО, Россия). Результаты исследования обрабатывали статистически с помощью программы Ехсе1.7 с использованием /-критерия Стьюдента.

Результаты и их обсуждение

Установлено (см. таблицу), что интраперитонеальное введение NPY интактным животным вызывало достоверное увеличение концентрации и содержания инсулина в островках, а также увеличение содержания глюкагона в ot-клетках. Остальные показатели достоверно не изменялись. Эти эффекты, по-видимому, обусловлены прежде всего непосредственным влиянием NPY на клетки островков Лангерганса. Поскольку концентрация инсулина и глюкозы в крови при увеличении содержания инсулина в р-клетках достоверно не изменялась, можно предположить, что в данном случае наблюдалось ослабление процесса его секреции. Сходные результаты были получены в экспериментах на изолированной поджелудочной железе [12]. Увеличение содержания глюкагона может быть связано с ослаблением под влиянием NPY ингибирующего действия инсулина на осклетки, которое в свою очередь обусловлено особенностями внутриостровковой регуляции [17].

При интрацеребровентрикулярном введении пептида интактным животным площадь островков, плошадь материала, иммунореактивного к инсулину, и его содержание в островках достоверно увеличивались по сравнению как с контрольной группой, так и с животными с интраперитонеальным введением (р < 0,001), а концентрация инсулина в островках уменьшалась. Эти данные позволяют предположить, что интрацеребровентрикулярное введение NPY вызывает усиление синтеза и секреции инсулина. В опубликованных ранее результатах работ с однократным интрацеребровентрикулярным введением NPY интактным животным факт усиления секреции инсулина также имел место [9]. Содержание глюкагона в осклетках в отличие от периферического пути введения NPY достоверно уменьшалось (/? < 0,001). Концентрация инсулина и глюкозы в плазме достоверно не изменялась.

Эти эффекты могут быть обусловлены дополнительным включением в процесс регуляции эндокринной функции поджелудочной железы и других механизмов, опосредованных структурами гипоталамуса, гипофиза и ствола мозга.

Так, известно, что в передней доле гипофиза NPY влияет на секрецию пролактина [16], оказывающего стимулирующее действие на процесс пролиферации р-клеток [5]. В гипоталамусе NPY может стимулировать секрецию вазопрессина и окситоцина в СОЯ и ПВЯ [8, 13, 20] с последующей реализацией их центральных и периферических инсулинстимулирующих эффектов [1, 2]. Кроме того, NPY может реализовывать свои эффекты через дорсальный комплекс блуждающего нерва [6], стимулирующее влияние которого на Р-клетки хорошо известно [3]. Содержание же глюкагона в ос-клетках уменьшается, по-видимому, вследствие усиления синтеза и секреции инсулина, которое при этом пути введения выражено в значительно большей степени. Кроме того, в этом случае может отмечаться и усиление секреции глюкагона, о чем свидетельствуют результаты экспериментов с однократным введением NPY в третий желудочек [9], а также нормальный уровень глюкозы в крови в наших исследованиях.

Хроническое интрацеребровентрикулярное и интраперитонеальное введение физиологического раствора нормальным животным не влияло на изучаемые нами показатели (р > 0,05).

Развитие сахарного диабета к концу исследования характеризовалось деструкцией островков Лангерганса, что выражалось в уменьшении площади островков, площади материала, иммунореактивного к инсулину, и содержания гормона в островках (р < 0,001). Концентрация инсулина в островках по сравнению с таковой в контрольной группе увеличивалась. Отмечалось достоверное увеличение количества идентифицированных в островках ос-клеток без изменения содержания в них глюкагона. В крови регистрировались гипергликемия и снижение концентрации инсулина (см. таблицу).

Как интраперитонеальное, так и интрацеребровентрикулярное введение NPY этим животным приводило по сравнению с диабетическими крысами к однонаправленным изменениям со стороны островков Лангерганса. Увеличивались площадь островков, площадь материала, иммунореактивного к инсулину, и его содержание в островках, что связано с торможением процесса деструкции р-клеток (см. таблицу). При этом концентрация инсулина в островках уменьшалась по сравнению с таковой у диабетических животных. Эти эффекты были более выражены при интрацеребровентрикулярном введении пептида (р < 0,001). Количество идентифицированных в островках осклеток уменьшалось практически до уровня контроля, а содержание глюкагона в них становилось достоверно ниже этого уровня, причем в более значительной степени при интраперитонеальном введении пептида (р < 0,001). При обоих способах введения в периферической крови отмечалось увеличение концентрации инсулина и снижение уровня гликемии по сравнению с диабетическими животными (р < 0,05).

Как и у нормальных животных, хроническое интрацеребровентрикулярное и интраперитонеальное введение физиологического раствора диабетическим крысам не влияло на изучаемые нами показатели (р > 0,05).

Таким образом, оба пути введения NPY диабетическим животным вызывают торможение деструкции р-клеток, усиление синтеза и секреции инсулина. Большая выраженность этих эффектов при интрацеребровентрикулярном пути введения предполагает, как и у интактных животных, участие центральных механизмов [6, 8, 16, 21]. Уменьшение содержания глюкагона в ос-клетках при введении NPY диабетическим животным, повидимому, связано с усилением синтеза и секреции инсулина на фоне торможения деструкции р-клеток и его тормозным влиянием на ос-клетки [17]. При этом не исключается и прямое влияние NPY на ос-клетки, которое более выражено при периферическом введении пептида. Об усилении секреции глюкагона под влиянием NPY свидетельствуют также опубликованные ранее результаты работ, выполненных на перфузируемой поджелудочной железе [12] и на интактных животных с однократным интрацеребровентрикулярным введением NPY [9].

Следует обратить внимание на то, что влияние NPY на р-клетки у диабетических животных более выражено при интрацеребровентрикулярном пути введения, а на ос-клетки — при интраперитонеальном. Это дает основание полагать, что регуляция состояния а-клеток NPY осуществляется преимущественно путем прямого воздействия [12]. В регуляции же состояния р-клеток большее значение имеют свойства NPY как нейротрансмиттера и нейромодулятора в ЦНС.

Таким образом, нами показано, что эффекты хронического введения NPY зависят от пути введения пептида и состояния животных. Наиболее значительными эффектами являются стимуляция синтеза и секреции инсулина, а также торможение процесса деструкции р-клеток у крыс с сахарным диабетом, что имеет не только теоретическое, но и практическое значение для клинической диабетологии.

В свете выявленных нами положительных эффектов хронического введения NPY диабетическим животным представляется необходимым дальнейшее изучение его возможной роли как в патогенезе развития сахарного диабета, так и в способах его патогенетической терапии.

Выводы

1. Хроническое введение NPY крысам оказывает влияние на аи р-клетки в зависимости от пути введения пептида и состояния животных.
2. Введение NPY животным с сахарным диабетом вызывает увеличение площади островков и содержания в них инсулина, а также торможение деструкции р-клеток, уменьшение количества идентифицированных а-клеток в островках и содержания в них глюкагона, усиление секреции инсулина в кровь и снижение уровня гликемии.
3. У животных с сахарным диабетом влияние NPY на р-клетки более выражено при интрацеребровентрикулярном введении, а на а-клетки — при интраперитонеальном.