Современные представления о молекулярных механизмах действия производных сульфонилмочевины на КАТФ-каналы

Производные сульфонилмочевины стимулируют секрецию инсулина у больных сахарным диабетом типа 2, ингибируя (закрывая) АТФ-зависимые калиевые каналы (КАТФ-каналы) бета- клеток островков поджелудочной железы. Эффект производных сульфонилмочевины обусловлен их связыванием с регуляторной субъединицей (SUR) КАТФ-канала. Эти каналы были обнаружены и в других тканях организма: все они имеют общую каналообразующую субъединицу, но нередко различаются по строению регуляторной субъединицы SUR (например, SUR1 в бета-клетках, SUR2A в миоцитах, SUR2B в гладкомышечных клетках). Чувствительность КАТФ-каналов трех типов к производным сульфонилмочевины различна: гликлазид и толбутамид подавляют активность КАТФ-каналов бета-клеток, но не миоцитов или гладкомышечных клеток. Вместе с тем глибенкламид одинаково эффективно блокирует все 3 типа КАТФ-каналов. В этой статье отражены современные представления о молекулярных механизмах действия производных сульфонилмочевины на активность КАТФ-каналов в бета-клетках поджелудочной железы, а также клетках других тканей организма. Авторы подробно обсуждают, какое значение могут иметь полученные данные при лечении больных сахарным диабетом производными сульфонилмочевины . Кдтф-каиалы и секреция инсулина Сульфонилмочевина и ее производные, открытые Marcel Janbon в 1942 г., вот уже более 50 лет используются как средства, стимулирующие секрецию инсулина у больных сахарным диабетом типа 2. Вместе с тем только в 1985 г., исследователям уда- ’Работа выполнена при поддержке фонда the Welcome Trusr и Британской диабетической ассоциации. Исследования препарата гликлазид проводили при финансовой поддержке Фармацевтической Группы Сервье. лось выявить клеточные структуры, с которыми взаимодействуют эти соединения, и совсем недавно были раскрыты молекулярные механизмы действия производных сульфонилмочевины. В настоящее время синтезирован ряд различающихся по силе и времени действия производных сульфонилмочевины, которые являются активным началом некоторых гипогликемизирующих средств, широко применяемых в повседневной медицинской практике. Эти препараты стимулируют секрецию инсулина, действуя по одному механизму: сульфонилмочевина связывается с особым белком, который образует в плазматических мембранах бета-клеток поджелудочной железы так называемые АТФ-зависимые калиевые каналы (или Кдтф-каналы) [1, 2]. КАТФ-каналы обеспечивают перенос ионов калия через мембрану бета-клеток и играют важную роль в регуляции секреции инсулина не только под действием производных сульфонилмочевины, но и при изменении концентрации глюкозы плазмы [2, 3]. Рис. 1 отражает современные представления о механизмах стимуляции секреции инсулина бета-клетками поджелудочной железы [2, 3]. Известно, что секреция инсулина усиливается при повышении концентрации внутриклеточного Са. Повышение концентрации внутриклеточного Са обусловлено активацией потенциалзависимых Са-каналов, также расположенных на плазматической мембране бета-клеток. Состояние этих каналов (открыты, закрыты) определяется величиной трансмембранного потенциала, зависящего в свою очередь от активности Кдтф-ка- налов. Так, в нестимулированных бета-клетках Кдтф-каналы открыты, что приводит к образованию отрицательного трансмембранного потенциала (около -70 мВ), при котором потенциалзависимые Са-каналы остаются неактивны (закрыты). При повышении концентрации глюкозы в плазме она усиленно поглощается бета-клетками поджелудочной железы, в клетках активируются некоторые метаболические реакции, продукты которых блокируют (закрывают) КАТФ-кана- лы. Закрытие КАТФ-каналов приводит к деполяризации мембраны (уменьшению отрицательного трансмембранного потенциала), открытию потенциалзависимых Са-каналов, входу ионов Са в клетки, повышению их концентрации в цитоплазме и как следствие усилению секреции инсулина. В настоящее время механизмы регуляции активности КАТФ- каналов продуктами метаболизма глюкозы изучены недостаточно. Полагают, что важную роль в этом процессе могут играть внутриклеточные нуклеотиды АТФ и \^АДФ, соответственно ингибирующие и активирующие Кдтф- каналы [4, 5]. Согласно этой гипотезе, замедление метаболизма глюкозы сопровождается снижением концентрации внутриклеточного АТФ, накоплением MgАТФ и активацией КАТФ-каналов. С другой стороны, усиление метаболизма глюкозы приводит к накоплению внутриклеточного АТФ, снижению концентрации MgATФ и закрытию ионных каналов. Существует ряд данных, подтверждающих 100 МкМ толбутамида Рис. 2. КАТФ-каналы бета-клеток имеют 2 участка связывания толбутамида: высокоаффинный участок находится на субъединице SUR1, низкоаффинный - на субъединице Кйб.2. А - влияние толбутамида (0,1 мкМ) на активность КАТФ-каналов бета-клеток (Kir6.2/SUR1; а) и укороченной субъединицы Kir6.2.AC36 (мутантная форма Kir6.2), которая формирует калиевый канал в отсутствие SUR1 (б); Б - изменение общего тока, проходящего через Kir6.2/SUR1 (а) и Ктгб.2.ДС36 (б) каналы в зависимости от дозы толбутамида. На рис. 2,Б: по осям ординат - отношение проводимости каналов в присутствии (G) и в отсутствие (Gc) толбутамида; по осям абсцисс - доза толбутамида (в мкМ). В ооциты Xenopus вводили мРНК, кодирующие белки Kir6.2 и SUR1 или КЗг6.2.ДСЗб; величину тока, проходящего через инвертированные участки мембраны при изменении потенциала в пределах от -110 до 100 мВ, оценивали методом пэтч-клампа. центральную роль КАТФ-каналов в усилении секреции инсулина под действием глюкозы плазмы. Так, при генетических мутациях, приводящих к нарушению функциональных свойств КАТФ- канала, секреция инсулина становится нерегулируемой, и в крови резко снижается уровень глюкозы (такое состояние характерно для детской врожденной гипогликемии) [6, 7]. Напротив, при нарушениях метаболизма глюкозы КАТФ-каналы нередко остаются открытыми, что ведет к подавлению секреции инсулина (например, при юношеском сахарном диабете типа 2) [8]. Известно 2 класса лекарственных средств, взаимодействующих с КАТФ-каналами [9]. Наибольшее клиническое значение имеют производные сульфонилмочевины, которые, связываясь с определенными участками белковой молекулы, закрывают КАТФ-ка- налы, запуская тем самым каскад реакций, ведущих к усилению секреции инсулина [1, 10]. Для подавления секреции инсулина можно использовать препараты, активирующие КАТФ-каналы. Входящие в их состав соединения открывают КАТФ-каналы, что способствует сохранению отрицательного трансмембранного потенциала и снижению секреции инсулина даже в присутствии высоких концентраций глюкозы [11]. К наиболее эффективным препаратам, активирующим КАТФ-каналы бета-клеток, относят диазоксид, который иногда используют влечении больных с ги- перинсулинизмом и детской врожденной гипогликемией. Поданным молекулярных исследований, КАТФ-каналы бета- клеток образованы двумя белковыми субъединицами, организованными в октамерный комплекс (4:4) [12-14]. Одна из субъединиц (Kir6.2) формирует в клеточной мембране пору для селективного переноса ионов калия: с ней связывается АТФ при закрытии канала [15]. Другая белковая субъединица выполняет регуляторные функции, иногда ее называют рецептором суль- фонилмочСвины (SUR1), так как на ней имеются участки свя- зывания препаратов этой группы [10]. Субъединица SUR1 регулирует активность Kir6.2 (открытие, закрытие КАТФ-канала), взаимодействуя либо с производными сульфонилмочевины, либо с МуАТФ или препаратами, активирующими трансмембранный перенос ионов калия [2]. Неизмененная субъединица Kir6.2 встраивается в плазматическую мембрану и образует канал для ионов калия только в присутствии регуляторной субъединицы SUR1. Однако существует мутантная форма Клт6.2.ДС (короче нативной субъединицы на 26-36 аминокислотных остатков), которая формирует нормально функционирующий КАГФ-канал независимо от SUB1 [15]. Мутантную форму Ктгб.2.ДС используют для изучения особенностей действия разных лекарственных препаратов на активность каналообразующей субъединицы КАТФ-канала. Производные сульфонилмочевины ингибируют Кдтф-каналы бета-клеток поджелудочной железы Механизм действия производных сульфонилмочевины изучали в экспериментах на ооцитах Xenopus, экспрессирующих клонированные белки КАТФ-канала [6-18]. Размеры ооцитов Xenopus достаточны для того, чтобы методом микроинъекции ввести в них мРНК, кодирующие субъединицы Kir6.2 и SUR1. Через 1-2 дня в ооцитах синтезируются соответствующие белковые молекулы, которые встраиваются в плазматическую мембрану и формируют КАТФ-каналы. Большинство из них закрыты, так как в цитоплазме интактных ооцитов высока концентрация АТФ, однако эти каналы можно активировать, подавив некоn рые метаболические реакции в клетках или поместив участок плазматической мембраны в цитозольный раствор, не содержащий нуклеотидов. Разработан специальный метод (известный как метод пэтч-клампа), позволяющий изучать суммарную активность нескольких сотен ионных каналов, расположенных на небольшом участке плазматической мембраны. Принцип этого метода заключается в следующем: с помощью особого устройства отделяют участок плазматической мембраны от клетки, при этом внешний слой мембраны крепится к регистрирующему электроду, а внутренний помещают в электролитный раствор. Все производные сульфонилмочевины жирорастворимы, хорошо проникают через клеточные мембраны и действуют одинаково эффективно, если их поместить в раствор, контактирующий с внешним или внутренним слоем плазматической мембраны. Так, добавление толбутамида в раствор, контактирующий с внутренним слоем мембраны, приводило к быстрому и обратимому уменьшению электрического тока, проходящего через Kiгб.2/SURl-кaнaлы (рис. 2, А). В дальнейшем выяснилось, что КАТФ-каналы имеют 2 участка связывания производных сульфонилмочевины: низкоаффинный участок находится на субъединице Kir6.2, высокоаффинный - на субъединице SUR1 [16]. Это предположение было основано на данных, согласно которым связь между концентрацией толбутамида и ингибированием тока через Kir6.2/SUR1 - каналы наиболее точно описывается кинетическими уравнениями для двух независимых участков связывания. Анализ результатов кинетических исследований показал, что ИК50 (концентрация препарата,-ингибирующая прохождение тока на 50%) для высокоаффинного и низкоаффинного участков составляет 2 мкМ и 2 мМ соответственно (рис. 2, Б). Для того, чтобы выяснить локализацию высоко- и низкоаффинных участков, был изучен эффект толбутамида на активность мутантной субъединицы Kir6.2.AC (которая способна формировать КАТФ-канал в отсутствие SUR1) [16]. На рис. 2, Б показано, что концентрация толбутамида, ингибирующая активность Kir6.2AC на 50%, близка к величине ИК50 для низкоаффинного участка комплекса Kir6.2/SUR1. Таким образом, очевидно, что низко- и высокоаффинные участки связывания сульфонилмочевины расположены на субъединицах Kir6.2 и SUR1 соответственно. При взаимодействии толбутамида с высокоаффинными местами связывания общий ток через изолированный участок мембраны снижается примерно на 60% (см. рис. 2). Вместе с тем в интактных ооцитах этот препарат полностью блокирует КАТФ-каналы, что обусловлено наличием в цитозоле клеток МБАДФ, который усиливает способность сульфонилмочевины ингибировать активность Kir6.2/SURl-KaHaaoB [16, 19]. Аналогичные данные были получены при изучении эффектов других препаратов: глибенкламида и производного бензойной кислоты - меглитинида [17]. Как и толбутамид, эти лекарственные препараты взаимодействуют с высоко- и низкоаффинными участками связывания на субъединицах SUR1 и I<ir6.2. Однако они являются более сильными ингибиторами, чем толбутамид: ИК50 глибенкламида, меглитинида и толбутамида для высокоаффинных участков связывания составляет 4 нМ, 0,3 мкМ и 2 мкМ соответственно [17]. Кроме того, эти препараты связываются с низкоаффинными участками на субъединице Kir6.2, что, впрочем, не имеет какого-либо клинического значения, так как в крови больных сахарным диабетом никогда не наблюдают столь высокой концентрации лекарственных препаратов [20, 21]. Терапевтический эффект производных сульфонилмочевины обусловлен исключительно их связыванием с высокоаффинными участками на субъединице SUR1. Ткансспецифичные эффекты производных сульфонилмочевины КАТФ-каналы были обнаружены не только в бета-клетках поджелудочной железы, но и в клетках многих других тканей, в том числе в сердце, гладких и скелетных мышцах, некоторых нейронах головного мозга [2, 22-26]. Хотя роль КАТФ-каналов в этих тканях изучена плохо, полагают, что они необходимы для согласования процессов внутриклеточного метаболизма и возбуждения плазматической мембраны, а также для проведения эффектов некоторых гормонов и биологически активных веществ. КАТФ-каналы миоцитов, как правило, закрыты и открываются только при явных нарушениях метаболизма (например, во время ишемии), что немедленно приводит к укорочению потенциала действия [22]. АТФ-зависимые калиевые каналы гладкомышечных клеток участвуют в регуляции сосудистого тонуса и, следовательно, артериального давления [23]. В скелетных мышцах КАТФ-каналы обеспечивают вход в клетку большого количества ионов калия во время интенсивной физической нагрузки, что является физиологической основой мышечной усталости [24]. Какую роль выполняют КАТФ-каналы в нейронах головного мозга, пока неясно, возможно, они участвуют в компенсаторных реакциях, развивающихся при ишемии головного мозга и недостаточном поступлении глюкозы [25, 26]. КАТФ-каналы из клеток разных типов имеют общую субъединицу Kir6.2, но нередко различаются по строению регуляторной субъединицы SUR [2]. Например, КАТФ-каналы бета-клеток поджелудочной железы образованы субъединицами Kir6.2 и SUR1, миоцитов - К1г6.2 И SUR2A, гладкомышечных клеток- Kir6.2 и SUR2B. В клетках головного мозга выявлены комплексы двух типов Kir6.2/SUR1 и Kir6.2/SUR2B. Существуют данные о том, что КАТФ-каналы указанных типов имеют разную чувствительность к производным сульфонилмочевины. Например, гликлазид (рис. 3, А) и толбутамид в низких концентрациях блокируют АТФ-зависимые калиевые каналы бета-клеток поджелудочной железы (Kir6.2/SUR1), но не миоцитов (Kir6.2/SUR2A). По-видимому, регуляторная SUR2A не имеет высокоаффинных участков связывания производных сульфонилмочевины [17, 18, 27]. На рис. 3, Б показано ингибирование активности клонированных КАТФ-каналов бета-клеток и миоцитов разными дозами гликлазида. Как низкие, так и высокие концентрации гликлазида уменьшают величину тока через каналы Kir6.2/SUR1. В отличие от этого активность каналов Kir6.2/SUR2A ингибировали только высокие дозы препарата, что свидетельствует о наличии в этом комплексе одного низкоаффинного участка связывания сульфонилмочевины. Более того, HKW для низкоаффинных участков связывания в этих типах каналов (Kir6.2/SUR1 и Kir6.2/SUR2A) не отличалась от величины ИК50, полученной для мутантного белка Kir6.2AC 36, формирующего канал в отсутствие регуляторной субъединицы SUR (2,7 мМ) [18]. Суммируя эти данные, можно сделать заключение о том, что если низкоаффинные участки связывания сульфонилмочевины расположены на субъединице Kir6.2, то высокоаффинные - только на субъединице SUR1, но не SUR2A. КАТР-каналы бета-клеток содержат регуляторную субъединицу SUR1, на которой расположено 2 высокоаффинных участка связывания - для производных сульфонилмочевины (например, толбутамида, гликлазида) и бензамидов (меглитинид). Регуляторная субъединица КАТФ-каналов миоцитов (SUR2A) имеет только 1 высокоаффинный участок связывания бензамидов. Молекула глибенкламида содержит как бензамидную группу, так и остатки сульфонилмочевины, и поэтому способна взаимодействовать с двумя высокоаффинными участками связывания на субъединице SUR1, но только с одним участком на субъединице SUR2A. Как следствие, после блокирования КАТФ-каналов глибенкламидом общий ток через каналы Kir6.2/SUR1 восстанавливается медленней, чем через Kir6.2/ SUR2A. Перепечатано из [2]: Ashcroft FM, Gribble FM. ATP-sensitive K+ channels and insuline secretion; their role in health and disease. Diabetologia. 1999; 42:903-919. Copyright © 1999, Springier Verlag. Гликлазид обладает большим сродством к SURI, чем толбутамид (ИК50 -50 нМ и 2 мкМ соответственно). Единственное структурное различие между этими препаратами заключается в том, что молекула гликлазида имеет азабициклооктильную группу, которая, по-видимому, и обеспечивает высокоаффинное связывание гликлазида с регуляторной субъединицей SUR1. Блокирование КАТФ-каналов, вызванное толбутамидом и глик- лазидом, легко обратимо. Меглитинид является производным не сульфонилмочевины, а бензойной кислоты, однако по химическому строению этот препарат во многом близок к глибенкламиду (за исключением остатков сульфонилмочевины). На фоне введения меглитинида наблюдают обратимое "высокоаффинное" ингибирование активности Кдтф-каналов двух типов - Kir6.2/SUR1 и Kir6.2/SUR2A (см. рис. 3) [17]. Полученные в этих исследованиях характеристики ингибирования были практически одинаковы: ИК.5О для Kir6.2/SUR1 и Kir6.2/SUR2A составляют 0,3 и 0,5 мкМ соответственно. Следовательно, регуляторные субъединицы SUR1 и SUR2A могут иметь отдельные высокоаффинные участки связывания для бензамидов. Показано, что низкие концентрации глибенкламида блокируют активность КАТФ-каналов в бета-клетках поджелудочной железы (Kir6.2/SUR1) и миоцитах (Kir6.2/SUR2A) (ИК5()составляет 4 и 27 нМ соответственно; рис. 3, В) [17]. Аналогичные результаты были получены при использовании другого гипогли- кемизирующего препарата - глимепирида (Song, Ashcroft, In press). Молекулы глибенкламида и глимепирида содержат как бензамидную группу, так и остатки сульфонилмочевины, поэтому данные препараты могут взаимодействовать с толбутамидными и бензамидными связывающими местами на субъединице SUR1 или только с бензамидными связывающими местами на субъединице SUR2A (рис. 4). Более того, предлагаемая нами гипотеза объясняет, почему ингибирование каналов Kir6.2/SUR1 глибенкламидом (и глимепиридом) малообратимо (нет явных изменений активности за время электрофизиологического эксперимента), тогда как общий электрический ток через каналы Kir6.2/SUR2A восстанавливается довольно быстро. Ясно, что ингибирующий эффект сохраняется до тех пор, пока полностью не диссоциирует комплекс препарат-SUR, однако, если глибенкламид взаимодействует с двумя высокоаффинными участками связывания на субъединице SUR1, такой комплекс будет диссоциировать крайне медленно. С другой стороны, комплекс препарата с субъединицей SUR2A (имеющей только 1 высокоаффинный участок связывания) диссоциирует гораздо быстрее, и, следовательно, быстрее восстанавливается активность КАТФ- каналов. Ранее уже отмечалось, что в интактных клетках, имеющих каналы Kir6.2/SUR1, ингибирующий эффект производных сульфонилмочевины усиливается в присутствии МёАДФ. Вместе с тем показано, что У^АДФ, напротив, препятствует блокированию Kir6.2/SUR2A глибенкламидом, действие которого на Кдтф-каналы миоцитов во много раз менее выражено, чем на КДТФ-каналы изолированных участков плазматической мембраны. [27]. Эти данные имеют большое значение для практики, поскольку они указывают на то, что в физиологических условиях производные сульфонилмочевины, эффективно блокируя Кдтф-каналы бета-клеток островков поджелудочной железы, мало влияют на функциональное состояние Kir6.2/SUR2A-Kana- лов миоцитов. Более того, производные сульфонилмочевины способны воздействовать на такие каналы только в том случае, если они уже открыты (действительно, нельзя заблокировать закрытые каналы!), но в физиологических условиях КАТФ-каналы большинства клеток (отличных от бета-клеток) находятся в неактивном состоянии. Клиническое применение КАТф-каналы обнаружены не только в бета-клетках поджелудочной железы, но и в других тканях организма, и очевидно, что препараты, взаимодействующие с каналами разных типов, могут вызывать большее количество побочных реакций. В связи с этим особую практическую значимость приобретает вопрос о терапевтической эффективности производных сульфонилмочевины с разной (толбутамид, гликлазид) или одинаковой (глибенкламид) специфичностью к Кдтф-каналам бета-клеток, миоцитов и гладкомышечных клеток. По-видимому, наибольшее клиническое значение могут иметь побочные реакции, развивающиеся на фоне приема производных сульфонилмочевины со стороны сердечно-сосудистой системы. Однако в физиологических условиях большинство КАТФ-каналов в миоцитах закрыто, и их активацию наблюдают только при определенных нарушениях метаболизма миокарда, например во время эпизода ишемии миокарда [22]. Таким образом, маловероятно, что прием глибенкламида будет сопровождаться неблагоприятными эффектами у больных, не имеющих ИБС или других заболеваний сердечно-сосудистой системы. Хорошо известно, что внутриклеточный М§АДФ ослабляет ингибирующее действие препаратов сульфонилмочевины на калиевые каналы [17, 27], поэтому даже в терапевтических концентрациях препараты этого ряда не способны полностью блокировать 1<АТФ-каналы, которые активируются в миоцитах во время эпизода ишемии миокарда. Так, согласно результатам проспективного клинического исследования UKPDS (the UK Prospective Diabetes Study), смертность и частота осложнений сахарного диабета у больных, получавших инсулин, глибенкламид или хлорпропамид, были одинаковы [28]. Следует отметить, что в задачи исследования UKPDS не входила оценка побочного действия сульфониламидов на сердечно-сосудистую систему. Кроме того, при окончательном анализе в группу глибенкламида включали больных, принимавших этот препарат только в начале исследования, а в дальнейшем получавших курс инсулино- терапии. В настоящее время неясно, как связаны терапия производными сульфонилмочевины и смертность у больных с сочетанием сахарного диабета типа 2 и ИБС [29]. Вместе с тем при планировании дополнительных клинических исследований следует учитывать тот факт, что только некоторые из производных сульфонилмочевины обладают высокоаффинным сродством к КАТФ-каналам миоцитов.