Гемостатические свойства эндотелия при диффузном токсическом зобе

Диффузный токсический зоб (ДТЗ, болезнь Грейвса) является одним из наиболее распространенных заболеваний щитовидной железы, сопровождающихся повышенной продукцией тиреоидных гормонов [10]. В настоящее время ДТЗ рассматривается как генетическое аутоиммунное заболевание, поскольку во всех процессах инициации и поддержания аутоиммунной агрессии непосредственное участие принимают HLA-молекулы, преимущественно II класса [8]. Возникновение ДТЗ может быть обусловлено генетическими дефектами, нарушением антигенраспознающей функции иммунокомпетентных клеток, изменением тиреоидного эпителия и экспрессией на его поверхности антигенов II класса HLA, что приводит к аутоиммунному повреждению ткани щитовидной железы [1].

Иммунологические нарушения у больных ДТЗ наблюдаются одновременно с развитием гемодинамических и сосудистых расстройств, что позволяет высказать предположение о важной роли функциональных изменений сосудистого эндотелия в патогенезе заболевания. В последние годы для определения функциональной активности эндотелиоцитов при сосудистой патологии проводится исследование тромборегуляторов эндотелиального происхождения, в том числе тканевого активатора плазминогена (t-PA), его специфического ингибитора (PAI-1), а также количество циркулирующих в крови эндотелиальных клеток [3].

Целью работы явилось изучение влияния иммунокомпетентных клеток и цитокинов фактора некроза опухоли а - ФНОа, интерлейкина (ИЛ-8 и ИЛ-1) на функциональную активность эндотелия при ДТЗ на фоне тиреотоксикоза.

Материалы и методы

Обследованы 38 женщин (средний возраст

• ± 4,1 года), страдающих ДТЗ, из которых у 26 определялся тиреотоксикоз, а 12 находились в ремиссии (состояние эутиреоза сохранялось в течение 1 года после отмены тиреостатической терапии). Диагноз верифицирован на основании клинических и лабораторных данных. До начала лечения проведено обследование 26 больных с длительностью заболевания 3-6 мес, что позволяло исключить иммуносупрессивное действие антитиреоидных препаратов. Всех больных обследовали с целью исключения сопутствующих бактериальных и вирусных инфекций, влияющих на уровень цитокинов в сыворотке крови.

Трийодтиронин (Т₃), тироксин (Т₄), тиреотропный гормон (ТТГ) и аутоантитела к тиреоглобулину определяли методом иммуноферментного анализа (ИФА) на автоматическом анализаторе ES-300 фирмы "Boehringer Mannheim" (Австрия). Использовали тест-системы этой же фирмы. Содержание t-PA в плазме устанавливали с помощью твердофазного ИФА с тест-системами фирмы "Diagnosti- ka Stago" (Франция).

Для оценки уровня ингибитора активатора плазминогена использовали колориметрический тест с применением хромогенного субстрата (набор PAI chromogenic, фирма "Diagnostika Stago", Франция). Принцип метода основан на образовании PAI-1, содержащегося в испытуемой плазме крови, комплекса с добавляемой урокиназой и уменьшении превращения плазминогена в плазмин. Количество образующегося плазмина обратно пропорционально уровню PAI-1 в испытуемой плазме.

Циркулирующие эндотелиоциты в крови вместе с тромбоцитами выделяли центрифугированием 1000 об/мин в течение 10 мин с последующим осаждением кровяных пластинок с помощью аденозиндифосфата. Количество клеток эндотелия подсчитывали в двух сетках камеры Горяева методом фазово-контрастной микроскопии [7]. Концентрацию цитокинов (ИЛ-1, ИЛ-8 и ФНОа) в сыворотке определяли методом ИФА с использованием отечественных моноклональных антител (НИИ особо чистых биопрепаратов, Санкт-Петербург).

Для оценки гетерогенности популяций лимфоидных клеток по экспрессируемым маркерам клеточной поверхности использовали моноклональные антитела серии DACO (Дания).

Для статистической обработки данных использовали r-тест Стьюдента и расчет коэффициента корреляции Пирсона (г). Данные представлены в виде X ± х, где X - среднее арифметическое, ах - стандартная ошибка средней.

Результаты и их обсуждение

При сравнении показателей клеточного иммунитета первичных больных и в периоде ремиссии заболевания (табл. 1) статистически значимые различия установлены в содержании клеток, несущих CD4⁺ и HLA-DR⁺, уровень которых был повышен на фоне тиреотоксикоза, а также отмечалось увеличение соотношения CD4/CD8, в то время как в субпопуляции лимфоцитов с кластерами дифференцировки CD3, CD8, CD20, CD16 изменений не наблюдалось.

Следовательно, результаты анализа субпопуляционного состава иммунокомпетентных клеток свидетельствуют о повышении иммунологической реактивности при тиреотоксикозе, которое проявляется увеличением Т-хелперов (CD4⁺), изменением соотношения CD4⁺/CD8⁺ и возрастанием HLA- DR⁺ - показателя активности Т- и В-клеток. Изменение содержания CD4⁺ и соотношения CD4⁺/

Таблица 1

Субпопуляционный состав иммунокомпетентных клеток больных ДТЗ

При ме ча ние. Здесь и в табл. 2, 3: * - р < 0,05.

Таблица 2

Изменение содержания цитокинов ФНОа, ИЛ-1 и ИЛ-8 в сыворотке крови больных ДТЗ

CD8⁺, вероятно, влияют на процессы апоптоза при ДТЗ, так как именно эти клетки представляют собой основу антигензависимой запрограммированной гибели клеток [5, 12].

Об активации иммунной системы при ДТЗ также свидетельствует повышение спонтанной продукции некоторых цитокинов (табл. 2).

Содержание ФНОа и ИЛ-8 при тиреотоксикозе было статистически значительно выше, чем в периоде ремиссии заболевания, в то же время различий в уровне ИЛ-1 в сыворотке крови не выявлено. Исследуемые цитокины являются участниками клеточно-опосредованных иммунных реакций. ФНОа путем запуска каскада реакций фрагментации ДНК. способствует апоптозу, активирует эндотелиоциты и на их поверхности вызывает экспрессию молекул адгезии и совместно с ИЛ-1 может быть причиной повреждения эндотелия [4, 12]. Между содержанием в крови ФНОа и уровнем антител к тиреоглобулину установлена положительная корреляция (г = 0,61, р < 0,01), которая является подтверждением участия туморнекротическо- го фактора в механизме повреждения ткани щитовидной железы. При анализе динамики изменения содержания активированных лимфоцитов, несущих HLA-DR⁺ и ИЛ-8, мишенями которого являются Т- и В-клетки, отмечена положительная корреляционная зависимость (г = 0,51, р < 0,05), также свидетельствующая о цитокиновом механизме регуляции иммунологических реакций при ДТЗ.

Длительное воздействие циркулирующих в крови избыточных концентраций тиреоидных гормонов, активированных Т- и В-лимфоцитов, ФНОа, ИЛ-8 на эндотелий сосудов - их специфическую мишень в реакциях межклеточного взаимодействия [6, 12], может быть причиной не только повы-

Табл и ца 3

Изменение содержания t-PA, PAI-1 и циркулирующих эндотелиоцитов при ДТЗ

Маркеры повреждения эндотелия

Примечание. ** - р < 0,01.

шения метаболической и функциональной активности, но и повреждения эндотелиоцитов. Как показали исследования образующихся в эндотелии и выделяемых в кровь t-PA и PAI-1, происходит значительное изменение их содержания при ДТЗ (табл. 3). Последующий анализ выявил сильную корреляционную зависимость (г = 0,94) между уровнем тиреоидных гормонов и повышением в крови содержания t-PA и значительную отрицательную корреляционную связь с содержанием PAI-1 (г = -0,52). Нарушение гемостатического баланса в сторону увеличения выработки t-PA, по- видимому, является одной из причин повышения фибринолитического потенциала крови при ДТЗ.

Существенное увеличение количества циркулирующих эндотелиоцитов у больных при гипертиреозе по сравнению с периодом ремиссии (р < 0,01) свидетельствует об усилении повреждения эндотелиальных клеток при повышении содержания тиреоидных гормонов в крови. В то же время наличие положительной корреляционной связи между уровнем антител к тиреоглобулину и содержанием эндотелиальных клеток в крови (г = 0,46, р < 0,05) также указывает на участие иммунологических механизмов в деструкции эндотелиального слоя сосудистой стенки.

Следовательно, взаимодействие с внутренней стенкой сосудов активированных Т- и В-клеток, избыточного количества тиреоидных гормонов, а также ИЛ-8 и ФНОа, мишенью для которых являются эндотелиальные клетки, приводит к стимуляции эндотелия, увеличению образования t-PA и уменьшению содержания PAI-1 и последующему повреждению эндотелиального пласта, которое происходит, вероятно, при непосредственном участии ФНОа, индуцирующего апоптоз, и сопровождается увеличением в крови количества эндотелиальных клеток, что позволяет t-PA, PAI-1 и циркулирующие в крови эндотелиоциты считать маркерами повреждения эндотелия при ДТЗ.

Протеолитическая система плазминоген-t- РА-PAI-1-плазмин имеет важное значение не только в регуляции системы фибринолиза, но и вовлекается во многие физиологические и патологические процессы. При ряде аутоиммунных заболеваний происходит быстрое снижение протеолитической сывороточной активности, которое сопровождается изменением отдельных компонентов иммунной системы и увеличением продукции цитокинов и адгезивных молекул, определяющих динамику заболевания [13-15]. ФНОа, как известно, участвует в обеспечении адгезии лимфоцитов к эндотелиальным клеткам за счет повышения экспрессии на эндотелии адгезивных молекул ICAM- 1 и на лимфоцитах интегрина LFA-1 [4, 5, 7]. Повышение в сыворотке больных с тиреотоксикозом цитокинов ФНОа и ИЛ-8 и выявленная корреляционная зависимость между активированными лимфоцитами и уровнем цитокинов свидетельствуют о выраженной иммунологической активности, приводящей к взаимодействию лимфоцитов с эндотелиальными клетками за счет усиления поверхностной экспрессии на эндотелиоцитах молекул межклеточной адгезии и к лимфоидной инфильтрации щитовидной железы [4]. При участии молекул адгезии мигрирующие клетки связываются с базальной мембраной эндотелия, выделяют ферменты, лизирующие коллаген и другие компоненты мембраны, что обеспечивает проникновение лейкоцитов в ткань. Существенные изменения прокоагулянтной и фибринолитической активности лейкоцитов возникают при заболеваниях, сопровождающихся изменением иммунного статуса организма [11]. Стимуляция под действием гормонов щитовидной железы лимфоцитов приводит к выбросу активаторов плазминогена, содержащихся в составе лизосомальных ферментов клеток, и активации клеточного фибринолиза, связанного с эндотелием, лейкоцитами и тромбоцитами [2, 10]. Этот процесс поддерживает специфическую активность как местного, так и системного фибринолиза.

Заключение

Таким образом, результаты исследования больных ДТЗ на фоне тиреотоксикоза свидетельствуют о важной роли нарушений механизма иммунологической регуляции в патогенезе повреждения сосудистого эндотелия, которое проявляется увеличением уровня t-PA и циркулирующих эндотелиоцитов и уменьшением содержания PAI-1, а неадекватная активация фибринолиза является результатом изменения гемостатических свойств эндотелия у больных ДТЗ на фоне тиреотоксикоза.