Окислительный стресс: клинико-метаболические показатели и полиморфный маркер гена каталазы при развитии ретинопатии у больных сахарным диабетом II типа

Сахарный диабет II типа, или инсулиннезависимый сахарный диабет (ИНСД), является не только наиболее распространенной формой нарушения углеводного обмена с угрожающе быстрым ростом заболеваемости, но и клинически весьма гетерогенной и этиологически мультифакторной патологией с выраженным генетическим компонентом. Как и основное заболевание, сосудистые осложнения сахарного диабета также клинически и генетически гетерогенны и этиологически мультифакторйы, а гипергликемия является главным, хотя и не единственным этиологическим фактором (фактором риска) всех хронических осложнений диабета. В последние годы заметно активизировалось изучение генетической предрасположенности или устойчивости к сосудистым заболеваниям. Весьма успешным, несмотря на достаточно противоречивые данные, оказалось изучение ассоциации полиморфных маркеров различных генов-кандидатов с ангиопатиями, в том числе и диабетическими [1].

Диабетическая ретинопатия (ДР) остается одним из серьезнейших осложнений сахарного диабета, приводящим к снижению остроты зрения вплоть до полной его потери и в результате — к инвалидизации, общему ухудшению качества и снижению продолжительности жизни больных. Пролиферативная ДР, как правило, ассоциируется с другими осложнениями диабета, прежде всего с нарушением функции почек, выражающимся в нефропатии (клинической протеинурии) и в ее доклинической стадии — микроальбуминурии [9, 10].

Одним из механизмов структурно-функциональных нарушений, лежащих в основе как специфических диабетических ангиопатий (ретинои нефропатии), так и общих сосудистых поражений, значительно ускоренных при диабете (атеросклероз), является окислительный стресс [4, 23]. Повышение концентрации глюкозы в крови и в не зависимых от инсулина тканях (эндотелий сосудов, нейроны) сопровождается образованием крайне реакционноспособных свободных радикалов [11] и ослаблением антиоксидантной защиты [16, 22]. Эти процессы прямо или косвенно участвуют в развитии всех хронических осложнений сахарного диабета, а при ИНСД усугубляются еще и такими специфическими факторами риска, как дислипидемия, артериальная гипертензия и склонность к тромбозам, представляя классический пример мультифакторных патологий [8]. Связанное с гипергликемией повышение уровня свободных радикалов и неспособность системы антиоксидантной защиты справляться с возрастающей при сахарном диабете нагрузкой особенно пагубны для эндотелиальных клеток [6], а такой важный элемент сетчатки, как перициты, наиболее чувствителен к повышению концентрации глюкозы [15].

Нами впервые предпринята попытка изучить у больных ИНСД, осложненным ДР, связь между основными клинико-метаболическими показателями и недавно описанным полиморфным маркером [18], располагающимся вблизи гена каталазы (CAT) — одного из ключевых ферментов антиоксидантной защиты. Хотя работа первоначально не планировалась как популяционно-генетическая, и потому группы ’’случай” и "контроль” специально не формировали, полученные результаты предполагается применить для планирования специальных исследований в области генетической предрасположенности к диабетическим ангиопатиям с использованием полиморфных маркеров различных генов-кандидатов, в том числе и генов антиоксидантных ферментов.

Материалы и методы

Обследовано 43 больных ИНСД. Комплекс обследований включал как физические и общеклинические показатели: пол, возраст, длительность диабета, индекс массы тела (ИМТ), артериальное давление (АД), так и изучение липидного спектра сыворотки крови: общего холестерина (ОХ), триглицеридов (ТГ), липопротеинов высокой (ЛПВП) и низкой (ЛПНП) плотности, а также фибриногена (ФБГ). Количественное определение этих показателей проводили на биохимическом анализаторе "Abbott Spectrum” ("Abbott Laboratories”, США). Были определены также коагулограммы (коагулометр фирмы "Schnitger & Gross", Германия), содержание малонового диальдегида (МДА) сыворотки крови как показатель перекисного окисления липидов по методу [21] и активность супероксиддисмутазы (СОД) эритроцитов методом [17] в модификации [2].

Офтальмологическое обследование больных с оценкой патологических изменений проводили в соответствии с классификацией [13], используя следующую шкалу: ДРО — признаки ретинопатии отсутствуют; ДР1 — непролиферативная ретинопатия (простая, фоновая — характеризуется наличием микроаневризм, ретинальных кровоизлияний, твердых экссудативных очажков); ДР2 — препролиферативная (характеризуется наличием венозных аномалий, мягких экссудативных очажков, множеством ретинальных кровоизлияний, наличием ишемических зон с тенденцией к локальной неоваскуляризации, а также образованием шунтов); ДРЗ — пролиферативная (характеризуется распространенной неоваскуляризацией, обширными преретинальными кровоизлияниями, кровоизлияниями в стекловидное тело, ретинальным фиброзом). В соответствии с этой шкалой всех больных ИНСД разделили впоследствии на 2 основные категории: "ДР+" — диабет, осложненный ретинопатией (формы/стадии ДР1—ДРЗ), и "ДР—" — диабет без ретинопатии (ДРО).

Выделение геномной ДНК из венозной крови обследованных осуществляли методом фенол-хлороформной экстракции [12]. Амплификацию полиморфного участка ДНК вблизи гена CAT проводили с помощью полимеразной цепной реакции [18] на амплификаторе РНС-2 ("Techne", Великобритания). Продукты полимеразной цепной реакции разделяли с помощью электрофореза в 12% полиакриламидном геле и окрашивали серебром [19]. В работе использовали термостабильную ДНК-полимеразу Taq, полученную от НПО "Биотех" (Москва). Синтетические олигонуклеотиды получены от В. П. Вейко (ГНЦ РФ "ГосНИИ Генетика").

Сравнение частот встречаемости аллелей гена CAT в различных группах обследованных лиц проводили с использованием точного критерия Фишера, для определения достоверности различий клинико-лабораторных данных применяли одно или двусторонний /-критерий Стьюдента. Достоверными считали различия при р < 0,05.

Результаты и их обсуждение

Анализ основных физических, клинических, метаболических и генетических показателей у больных ИНСД проводили поэтапно. Первоначально все больные были разделены клинически на 2 группы: имеющие четкие признаки базальной, препролиферативной или пролиферативной ДР (группа "ДР+"; п = 27) и больные без ретинопатии (группа "ДР—"; п = 16). На этом этапе анализа выявлено существенное различие в длительности диагностированного диабета (табл. 1). Средняя продолжительность ИНСД, осложненного ретинопа-

Табл и ца 1

Основные физические и метаболические показатели в общих группах больных ИНСД с наличием (ДР+) и отсутствием (ДР-) ДР

Примечание. Здесь и в табл. 3 данные представлены как среднеарифметическое значение ± стандартное (среднеквадратичное) отклонение; нд — различия недостоверны (р > 0,05).

тией, была более чем в 1,5 раза выше по сравнению с продолжительностью диабета у больных без этой ангиопатии. По возрасту и соотношению мужчин и женщин (последние преобладали в обеих группах) больные групп "ДР+” и "ДР—” существенно не различались. Достоверные различия в длительности ИНСД, связанной главным образом с возрастом манифестации диабета (более ранним в группе "ДР+"), по-видимому, и обусловливают развитие ретинопатии, являясь при ИНСД одним из ее основных факторов риска [10]. Корреляция ДР с возрастом начала и длительностью ИНСД найдена также в немецкой популяции [24]. Кроме того, в нашем исследовании больные группы "ДР+" имели достоверно более высокий средний уровень ЛПВП (см. табл. 1), повышение которого относительно ЛПНП считается при ИНСД макроангиопротективным фактором [20]. Наблюдалось изменение концентрации и других компонентов липидного профиля крови, однако различия из-за небольшого объема выборок и столь характерной для ИНСД вариабельности этих показателей [20] были недостоверными. Такой потенциальный фактор риска ангиопатий, как степень компенсации углеводного обмена (и его количественный показатель — уровень Hb Aj/A_lc), мы не анализировали, тем более что некоторые исследователи также не придают этому показателю первостепенного значения при ИНСД из-за его слабой корреляции с другими факторами риска и самой сосудистой патологией [24]. Возможно, более важным для оценки риска ангиопатий у больных диабетом является не столько усредненный показатель гликемии, каким служит уровень гликированного гемоглобина, сколько суточная амплитуда колебаний гликемии, особенно ее пики после приема пищи [7].

Артериальная гипертензия является не только одной из характерных особенностей ИНСД, но и фактором риска диабетических микрои макроангиопатий вообще и ДР в частности [9, 10]. Наличие и тяжесть ДР, особенно при ИНСД, тесно связаны с гипертонией [24], поэтому в группе "ДР+" можно было ожидать более высоких значений АД по сравнению с группой "ДР—". Мы же, напротив, наблюдали в этой группе больных его снижение по сравнению с больными без ретинопатии, причем различие в уровнях систолического давления, даже несмотря на малые выборки, было достоверным (см. табл. 1). Этот парадокс можно объяснить, если допустить применение в группе больных с ретинопатией более интенсивной гипотензивной терапии по сравнению с больными без ретинопатии (кстати, имеющими меньшую длительность диабета, а также меньший опыт и мотивацию самоконтроля и выполнения рекомендаций наблюдающего врача). В любом случае эти результаты требуют проведения дополнительного исследования с более полным контролем всех факторов, потенциально влияющих на липидный спектр крови, АД, гемостаз и функции эндотелия сосудов в целом.

В этих же группах больных было изучено распределение аллелей гена CAT. Впервые описанный В. В. Носиковым и соавт. полиморфный маркер вблизи гена CAT [18] в русской (точнее, в московской) популяции представлен семью аллелями, причем один из них, длиной 161 пара нуклеотидов (п. н.), найден пока только у больных сахарным диабетом. Поскольку 7 аллелей могут образовывать 28 индивидуальных генотипов, а нами обследовано всего 43 больных ИНСД, в дальнейшем в разных группах больных мы сравнивали распределение частот встречаемости только аллелей гена CAT. Группы "ДР+" и "ДР—" по распространенности аллелей достоверно не различались (табл. 2), поэтому на основании этих данных нельзя судить о случайном или неслучайном распределении полиморфного маркера, т. е. невозможно сделать вывод ни о наличии, ни об отсутствии ассоциации этого генакандидата с ДР. Такая ситуация обусловлена, вопервых, малой величиной обследованных выборок, а во-вторых — несоответствием сравниваемых групп принципу "случай—контроль", обычно используемому при изучении на популяционном уровне генетической предрасположенности или устойчивости к патологии.

Поскольку 2 группы достоверно различались по длительности ИНСД (см. табл. 1), являющейся одним из основных факторов риска ДР, на следующем этапе анализа результатов мы разделили всех больных не по клиническим признакам ретинопатии, а по длительности ИНСД, и уже в каждой из этих групп выделили подгруппы имеющих ("ДР+") и не имеющих ("ДР—") ретинопатию (табл. 3 и 4). И, наконец, из этих 4 подгрупп больных мы выбрали 2, максимально различающиеся по длительности диабета и выраженности ДР: 1) наличие ретинопатии при сравнительно небольшой длительности ИНСД; 2) отсутствие ретинопатии при существенно большей длительности основного заболевания (см. табл. 3). Такой подход к формированию максимально различающихся ("полярных") фенотипов патологии и ее отсутствия с использованием неперекрывающихся критериев отбора больных уже был использован и оправдал себя при изучении генетической предрасположенности к диабетической нефропатии, позволив четко идентифицировать один из генетических маркеров предрасположенности и устойчивости к этой микроангиопатии в московской популяции [14]. В настоящей работе на втором этапе анализа результатов за точку разделения была выбрана длительность ИНСД, равная 10 годам, поскольку именно эта величина является медианой данного показателя в общей группе больных ИНСД. Все больные в зависимости от длительности диабета также были разделены на 2 основные группы: 1-я — длительность диабета до 10 лет включительно ("ИНСД < 10 лет"; п = 22); 2-я — длительность диабета 10 лет ("ИНСД > 10 лет"; п = 21). Как и ожидалось, в ка-

Таблица 2

Распространенность (в %) аллелей гена CAT в общих группах больных ИНСД с наличием (ДР+) и отсутствием (ДР-) ДР

Примечание. Различия между группами недостоверны (р > 0,05).

Таблица 3

Основные физические и метаболические показатели у больных ИНСД с наличием (ДР+) и отсутствием (ДР—) ДР в зависимости от длительности основного заболевания

При меч ан ие. * — р < 0,05; ** — р < 0,001 при сравнении с подгруппой больных с длительностью ИНСД более 10 лет без ретинопатии (подход "случай—контроль").

ждой из этих групп соотношение больных с ретинопатией (”ДР+”) и без нее ("ДР—”) было различным и оказалось смещенным в сторону преобладания этой микроангиопатии при увеличении длительности основного заболевания: 1/1 при небольшой длительности ИНСД и 3/1 при достоверно большей его длительности (см. табл. 3).

Несмотря на весьма небольшой объем исследованных выборок больных, дальнейшее разделение их на подгруппы оправдано необходимостью формирования групп с максимально выраженными фенотипами "случай” и "контроль” с учетом длительности ИНСД как основного фактора риска ДР. Такой подход позволил выявить более четкие различия физических, клинических и метаболических показателей между ИНСД, осложненным ("ДР+") и не осложненным ("ДР—") ретинопатией (см. табл. 3). Особенно наглядно это проявилось в группе больных с максимальной длительностью диабета, где наиболее атерогенный липидный спектр крови был характерен для больных с ретинопатией. Эти результаты согласуются с данными других исследова-

Таблица 4

Распространенность (в %) аллелей гена CAT у больных ИНСД с наличием (ДР+) и отсутствием (ДР—) ДР в зависимости от длительности основного заболевания

Примечание. Различия между группами "ДР+" и "ДР—" недостоверны (р > 0,05). * — р < 0,05 при сравнении с подгруппой больных с длительностью ИНСД более 10 лет без ретинопатии (подход "случай—контроль").

телей, нашедших при ИНСД ассоциацию ДР с повышенными уровнями ОХ и ТГ [24]. Для больных ИНСД с ретинопатией (особенно с большей длительностью диабета) также характерно снижение АД по сравнению с больными без ретинопатии.

Наиболее существенные различия липидного спектра наблюдались при анализе групп "случай" (длительность ИНСД < 10 лет и наличие ретинопатии) и "контроль" (длительность ИНСД > 10 лет без ретинопатии) (см. табл. 3). Даже несмотря на малые выборки (п = 11 и п = 5), эти различия были достоверны. При этом следует иметь в виду, что ДР является микроангиопатией, а для ИНСД более характерны макроангиопатии, ассоциирующиеся с атерогенным липидным спектром крови. Нельзя, однако, исключать и возможность этиопатогенетической гетерогенности ДР при ИНСД, как это имеет место в случае диабетической нефропатии [5], когда к микроангиопатии присоединяется поражение крупных сосудов. Вообще же нарушение липидного обмена играет важную роль в развитии не только макро-, но и микроангиопатий. В последнем случае это может осуществляться, по-видимому, за счет взаимного влияния дислипидемии и окислительного стресса на гемостаз [3], а при ДР, например, путем активации процессов коагуляции, приводящих к тромбозу капилляров сетчатки, развитию ишемии и неоваскуляризации.

В нашем исследовании концентрация фибриногена имела слабовыраженную тенденцию к повышению у больных ИНСД с ДР (см. табл. 1 и 3). Уровень МДА, считающегося одним из показателей окислительного стресса вообще и перекисного окисления липидов в частности, был ниже у больных с ретинопатией как в общей группе (см. табл. 1), так и при разделении больных по длительности диабета (см. табл. 3). Напротив, активность СОД эритроцитов у больных с ретинопатией в среднем была выше (см. табл. 1 и 3). Несмотря на недостоверность различий, диспропорция между уровнями МДА в сыворотке и активностью СОД в эритроцитах сохранялась независимо от поправки на длительность диабета. Можно предположить, что это обусловлено более интенсивным глюкозоиндуцированным окислительным стрессом при развитии ретинопатии и как следствие компенсаторным повышением активности СОД (ключевого фермента антиоксидантной защиты), как это было показано на культивируемых в условиях высокого содержания глюкозы в клетках эндотелия сосудов [6]. Кроме того, на оба вышеуказанных показателя могут влиять также пищевые, поведенческие и медикаментозные факторы.

При разделении всех больных на 2 основные группы в зависимости от длительности ИНСД неравномерность распределения аллелей гена CAT в подгруппах больных с наличием и отсутствием ретинопатии была более выраженной (см. табл. 4) по сравнению с такими же больными, но не дифференцированными по длительности диабета (см. табл. 2). Несмотря на то что в каждой возрастной группе подгруппы "ДР+" и "ДР—" по распространенности аллелей гена каталазы между собой различались недостоверно, сравнение по этому показателю подгрупп "случай" и "контроль" выявило существенное различие для аллеля 167 п. н. (см. табл. 4). Однако из-за малых величин обследованных групп интерпретация полученных результатов затруднена, и их следует рассматривать как предварительные. Обнаруженное нами различие в частоте встречаемости одного из 7 аллелей гена CAT нуждается в дополнительной проверке на значительно большем клиническом материале.

Несмотря на предварительный характер полученных результатов, они подтверждают важную роль окислительного стресса в развитии диабетических ангиопатий (в частности, ретинопатии) и указывают на необходимость дальнейшего изучения этого полиморфного маркера генов CAT и других антиоксидантных ферментов для оценки генетической предрасположенности к хроническим осложнениями сахарного диабета. Более того, полученные результаты могут стать основой для последующего дизайна молекулярно-генетических исследований диабетических ангиопатий на популяционном уровне, включающих специальные тесты для оценки окислительного стресса и антиоксидантного статуса больных.

Выводы

1. Из всех изученных физических, клинических и метаболических показателей у больных ИНСД основным и прямым фактором риска ДР оказалась длительность диабета.
2. Смещение липидного спектра крови у больных с ретинопатией в сторону повышения атерогенности, особенно при увеличении длительности диабета, и диспропорция между уровнями перекисного окисления липидов (МДА) и антиоксидантной защиты (СОД) свидетельствуют о важной роли окислительного стресса в развитии ДР при ИНСД.
3. Использование максимально выраженных клинических фенотипов "случай" (быстрое развитие ретинопатии) и "контроль" (устойчивость к развитию ретинопатии при большей длительности диабета) позволило выявить достоверное различие в распределении одного из аллелей полиморфного маркера гена CAT при развитии ретинопатии даже в малых выборках обследованных больных.
4. Полученные результаты указывают на необходимость разработки специального комплексного подхода для дальнейшего изучения полиморфных маркеров генов-кандидатов, кодирующих ферменты антиоксидантной защиты, как потенциальных факторов риска диабетических ангиопатий.