Роль отдельных типов серотониновых рецепторов в индуцированной присутствием самки активации гипофизарно-семенникового комплекса мышей

Главным фактором, инициирующим половое поведение у грызунов, являются феромоны самки, воспринимаемые самцом с помощью обоняния [2]. Установлено, что одно присутствие находящейся в эструсе самки за разделяющей животных и не допускающей физического контакта перегородкой вызывает у самцов мышей активацию гипоталамо-гипофизарно-ссменни- кового комплекса (ГГСК) и повышение уровня тестостерона в периферической крови [3, 4). Ранее нами было показано, что активирующее влияние присутствия рецептивной самки на уровень тестостерона в крови осуществляется с вовлечением люли- бериновых рецепторов трансаденогипофизарным путем [I]. Основная роль в этом процессе принадлежит гипоталамусу, который принимает непосредственное участие и в регулировании эмоционально-мотивационных реакций организма. В таких условиях в регуляции эндокринной функции семенников способны участвовать адренергические механизмы, причем выражен-

‘Работа поддержана Государственной программой Российского фонда фундаментальных исследований (грант № 99-0449932). Авторы благодарят компанию "Glaxo'' (Англия) за предоставленный в дар ондансетрон, а также признательны научному сотруднику Института цитологии и генетики СО РАН В. В. Булыгиной за консультации по статистической обработке полученных результатов. ность их влияния зависит от наследственных особенностей самца [12]. Гипоталамус является одной из наиболее богатых катехоламинами областей мозга, но. кроме того, он иннервируется и серотонинергическими волокнами, наиболее высокая концентрация которых отмечена в латеральной, медиальной и инфундибулярной областях [15]. В латеральной гипоталамической области серотонинергические волокна сосредоточены в медиальном пучке переднего мозга, через который осуществляется связь гипоталамуса со структурами лимбического мозга, коры и ствола мозга [14]. Вовлечение серотонинергической системы в регуляцию различных компонентов полового поведения является хорошо известным фактом [5]. В то же время четкого представления о роли серотонина в возникновении и поддержании половой активации не существует.

В последние годы молекулярно-биологическими методами выявлен значительный полиморфизм серотониновых (5-НТ) рецепторов [9]. В литературе накоплены данные о том, что различные типы и даже подтипы одного и того же типа 5-НТ-рецепторов мозга могут принимать участие в регуляции физиологических функций, оказывая различное влияние [6]. Существование гетерогенных 5-НТ-рецепторов, различающихся генами, системами вторичных посредников и региональным распределением, поднимает множество вопросов, одним из которых является выявление роли отдельных типов и подтипов серотониновых рецепторов в эндокринной регуляции половой системы.

Целью настоящего исследования было изучение роли различных типов 5-HTj- (5-НТ_1а и 5-НТ_|В), 5-НТ₂- (5-НТ_2Д, 5-НТ_2В и 5-НТ_2С) и 5-НТ₃-рецепторов в активации ГГСК самцов мышей, вызываемой присутствием рецептивной самки. Эти 3 типа 5-НТ-рецепторов различаются контролирующими их генами, способом передачи сигнала (рецепторы 5-НТ,-типа подавляют активность аденилатциклазы, 5-НТ₂-рецепторы стимулируют фосфолипазу С, а 5-НТ₃-рецепторы непосредственно встроены в ионные каналы) и чувствительностью к различным агонистам и антагонистам [9]. Исследование было проведено путем изучения влияния селективных 5-НТ_|А-агониста 8-OH-DPAT [9] и антагониста р-МРР1 [10], агониста 5-НТ_|д/|В-рсцепторов элтоп- разина [8], селективного 5-НТ,_в-агониста CGS 12066А [13], агониста 5-НТ_|В/2с-рецепторов TFMPP [8], селективных антагонистов 5-НТ^-рецепторов кетансерина [7] и 5-НТ₃-антагониста ондансетрона [8] на возникающее при предъявлении самки повышение уровня тестостерона в периферической крови самцов мышей.

Материалы и методы

Опыты проводили на самцах мышей линии СВА в возрасте 2,5-3 мес. Животных содержали в стандартных условиях вивария Института цитологии и генетики СО РАН в группах по 8 самцов при естественном освещении и со свободным доступом к воде и пище.

За 5 дней до опыта с целью снятия эффекта социальных взаимоотношений, которые устанавливаются в микропопуляциях, самцов мышей помешали в отдельные клетки, разделенные пластиковой перегородкой с отверстиями на 2 половины. В день эксперимента к каждому самцу в свободную половину клетки подсаживали самку линии BALB/c в состоянии эструса, вызванного введением за 24 ч до опыта 10 ЕД хорионического гонадотропина (профази, "Serono", Италия). Все используемые селективные агонисты и антагонисты вводили внутрибрюшинно за 20 мин до подсаживания самки. В отдельной серии опытов изучали эффекты исследованных препаратов на исходный уровень тестостерона в крови; в этих сериях, как и в опытах с самкой, животных декапитировали через 40 мин после введения препаратов. Фармакологический анализ первого типа 5-НТ-ре- цепторов проводили с использованием селективных агониста 5- НТ_|А-рецепторов 8-OH-DPAT (0,1 мг/кг; "Research Biochemicals Inc.", США) и антагониста p-MPPI НС1 (0,2 мг/кг; "Research Biochemicals Inc.", США); смешанного агониста 5-НТ_|д/|_В-рецеп- торов элтопразина (3,0 и 10,0 мг/кг; "Duphar", Англия); смешанного агониста 5-НТ,_в/2С-рецепторов TFMPP (5,0 мг/кг; "Duphar", Англия); селективного агониста 5-НТ,_в-рецепторов CGS- 12066А-малеата (1,0 и 2,0 мг/кг; "Research Biochemicals Inc.", США). Для выявления роли 5-НТ₂-рецепторов использовали селективный антагонист 5-НТ_2А-рецепторов кетансерина тартрат (1,0 и 2,0 мг/кг; "Janssen Pharmaceutica", Бельгия). Участие 5-НТ₃-рецепторов в активации ГГСК при половой активации оценивали с помошью блокатора этого типа рецепторов ондансетрона (0,05, 0,1 и 0,5 мг/кг; "Glaxo", Англия). 8-OH-DPAT, CGS-12O66A, элтопразин, TFMPP растворяли в физиологическом растворе, кетансерин и ондансетрон - в дистиллированной воде, р-МРР! - в 1 капле 10 н. НС1 и доводили дистиллированной водой до нужной концентрации, нейтрализуя 9 н. NaOH до окончательного pH раствора 3,5. Контрольным животным в тех же условиях вводили аналогичные объемы физиологического раствора, дистиллированной воды или растворителя.

Через 20 мин после подсаживания в соседний отсек самки или через соответствующее время в контрольных опытах самцов мышей декапитировали и собирали кровь из туловища. Плазму крови хранили при -18"С до анализа. Уровень тестостерона в плазме периферической крови определяли радиоиммунологи- ческим методом с применением ’Н-тестостерона ("Amersham") и высокоспецифичной антисыворотки. Статистическую обработку результатов проводили с помощью дисперсионного анализа (ANOVA/MANOVA, Statistica, 5) с post-hoc-сравнением групповых средних (Newman-Keul-test). Независимыми факторами были дозы препаратов и наличие самки за перегородкой.

Результаты и их обсуждение

Появление самки за перегородкой вызывало, как это было показано и раньше [3, 4], значительное повышение уровня тестостерона в периферической крови самца: через 20 мин после предъявления самки концентрация тестостерона в крови самцов

Изменение уровня тестостерона в крови самцов мышей в ответ на предъявление рецептивной самки после воздействия агонистами 5-НТ_)д-рецепторов 8-OH-DPAT и элтопразином и селективным антагонистом этих рецепторов р-МРРГ

К - контроль; / - 8-OH-DPAT (0,1 мг/кг); 2 - элтопразин (3 мг/кг); 3 - р-МРР1 (0,2 мг/кг); 4 - p-MPPI (0,2 мг/кг) + 8-OH-DPAT (0.1 мг/кг); 5 - р-МРР1 (0,2 мг/кг) + элтопразин (3 мг/кг).

♦ - р < 0,001 по сравнению с исходным уровнем; *• - р < 0,001 по сравнению со значениями гормона при половой активации в контрольной группе.

а - исходный уровень; б - половая активация.

По оси ординат - уровень тестостерона (в нг/мл).

линии СВА увеличилась почти в 2 раза (с 2,50 ± 0,56 до 4,84 ± 0,38 нг/мл; р < 0,001). Введение физиологического раствора или других растворителей, использованных в данной работе, несколько снижая абсолютные значения, не влияло на вызываемое самкой повышение тестостерона в крови.

Участие 5-НТ_1А-ренепторов в половом возбуждении вызывает особый интерес, поскольку имеются сведения об их участии в половом поведении самцов мышей и крыс [5]. Было установлено ингибирующее действие 5-НТ|_А-рсцепторов на индуцируемую присутствием рецептивной самки активацию ГГСК. Двухфакторный анализ показал, что на вызываемое самкой повышение уровня тестостерона в плазме крови самцов мышей ингибирующее действие оказывает как селективный агонист 5- НТ_1Д-рецепторов 8-OH-DPAT (F₄„ = 9,83; р < 0,001; см. рисунок), так и смешанный агонист 5-НТ_|д/|_В-рецепторов элтопразин (F_2S2 = 10,68; р < 0,001; см. таблицу). Взаимодействие факторов свидетельствует о том, что агонисты по-разному влияют на уровень тестостерона в присутствии и в отсутствие самки: не влияя на исходный уровень гормона, агонисты 5-НТ_|д-рецепто- ров достоверно снижали его в условиях полового возбуждения. Post-hoc-анализ показал отсутствие активирующего влияния рецептивной самки на ГГСК самцов мышей, обработанных агонистами 5-НТ,_А-рецепторов (р > 0,05 по сравнению с животными с пустым соседним отсеком).

Введение антагониста 5-НТ_|д-рецепторов р-MPPI не препятствовало повышению уровня тестостерона в условиях половой активации (р < 0,001; см. рисунок). Однако р-MPPI полностью предотвращал проявление ингибирующего влияния 8-OH- DPAT и элтопразина на реакцию гипоталамо-гипофизарно-се- менниковой системы (см. рисунок). Эти результаты хорошо соответствуют имеющимся данным о механизме действия этого селективного антагониста 5-НТ,_А-рецепторов, который назван "молчащим" 5-НТ_|А-антагонистом: р-MPPI ингибирует способность селективного агониста 5-НТ_|А-рецепторов 8-OH-DPAT угнетать стимулированную форсколином аденилатциклазную активность, но при этом сам по себе на активность аденилатциклазы не влияет [10]. По данным двухфакторного анализа концентрация тестостерона в эксперименте по совместному введению блокатора и агонистов 5-НТ_|д-рецепторов зависела и от препарата (Г, ₂₂₂ = 4,19; р < 0,001) и от присутствия самки (/■| ₂₂₂ = 126,96; р < 0,001). Достоверное взаимодействие факторов (F_{7 222} = 4,27; р < 0,01) указывает на то, что влияние препаратов на уровень тестостерона в крови в присутствии самки отличается от такового при пустом соседнем отсеке. Post-hoc - сравнение в рамках двухфакторного анализа подтвердило достоверность различий в значениях гормона при пустом отсеке и

Уровень тестостерона (в нг/мл) в плазме периферической крови при изменении активности серотонинергической системы у самцов мышей в условиях половой активации (М ± т) р < 0,61; ***-/>< 0,001 по сравнению с исходным уровнем; tt - р < 0,05; tttttt - р < 0,001 по сравнению с соответствующим растворителем.

половой активации. Уровень тестостерона повышался в присутствии самки во всех группах (р < 0,001), кроме 8-OH-DPAT и элтопразина (р > 0,05). Однофакторный дисперсионный анализ четко показал влияние 8-OH-DPAT и элтопразина на вызванную самкой половую активацию (F,_J04 = 4,44; р < 0,001) и отсутствие влияния препаратов на исходный уровень тестостерона (Л.ш ⁼ 1.63; р > 0,05) и на группу животных с предварительной блокадой 5-НТ|_А-рсцепторов р-MPPI (р > 0,05).

Из проведенного эксперимента следует, что ингибирующий э<|>фект смешанного агониста 5-НТ|.^,_в-рецепторов элтопразина связан со стимуляцией 5-НТ_1А-типа рецепторов, поскольку введение селективного агониста 5-НТ_|В-рецепторов CGS-12066A существенно нс влияло на гормональный ответ (Г₂₄₅ = 0,315; р > 0,05) и появление самки вызывало повышение уровня тестостерона в крови. сходное с повышением уровня тестостерона у мышей после введения физиологического раствора (р < 0,001, см. таблицу). Подтверждают специфичность вовлечения 5-НТ_|А-рецепторов в качестве факторов, ингибирующих активацию гипоталамо-гипофизар- но-семенниковой системы, и опыты с предварительным введением антагониста этого типа рецепторов р-MPPI, предотвращавшего ингибирующее влияние 8-OH-DPAT и элтопразина на повышение уровня тестостерона в крови (см. рисунок).

Результаты фармакологического анализа с применением селективного антагониста 5-НТ_|А-рецепторов показали, что в условиях возникновения полового возбуждения эти рецепторы не активированы, так как их блокада не влияет на вызываемое рецептивной самкой повышение уровня тестостерона в крови, но предотвращает ингибирующее действие агонистов этого типа рецепторов. Можно предположить, что в естественных условиях активация 5-НТ|_А-рсцепторов, предотвращающая активирование ГГСК, происходит в состоянии стресса, тревожности и депрессии, в регуляции которых хорошо установлено участие 5- НТ_|д-рецепторов [11].

Интересным оказался и факт отсутствия активации ГГСК в ответ на предъявление рецептивной самки после применения смешанного агониста 5-НТ|_В/2С-рецепторов TFMPP. Не влияя на исходный уровень гормона (F_IM = 1,33; р > 0,05), он оказывал ингибирующее действие при половой активации (F, |₇ = 16,17;/>< 0,001; см. таблицу). Вероятно, свое влияние он опосредует через 5-НТ_2С-рецепторы, поскольку 5-НТ,_в-рецеп- торы, по-видимому, не участвуют в регуляции ГГСК при половой активации, что было показано в экспериментах с введением селективного агониста этого типа рецепторов CGS-12O66A.

Блокирование активации ГГСК в ответ на предъявление самки происходило и после введения селективного антагониста 5-НТ^-рецепторов кетансерина (см. таблицу). Эти данные свидетельствуют о вовлечении 5-НТ₂-рецепторов в модуляцию начального этапа полового поведения. Поскольку антагонист этого типа рецепторов оказывал ингибирующее действие, можно полагать, что стимулирующее действие самки на ГГСК самца в определенной степени связано с активацией 5-НТ^-рецепто- ров. Важно отметить, что разные подтипы одного и того же 5-НТ₂- типа действуют противоположным образом: через 5-НТ^-подтип, по-видимому, опосредуется активирующее влияние серотонина на половую активацию, a S-HTjc-рецепторы вовлечены в ингибирующие механизмы. Это дает основание предполагать их реципрокное влияние на регуляцию поповой активации ГГСК.

Своеобразным оказалось влияние антагониста 5-НТ₃-рецеп- торов ондансетрона (см. таблицу). В дозе 0,5 мг/кг ондансетрон не оказывал влияния ни на исходный уровень тестостерона, ни на активирующее действие самки - уровень тестостерона в периферической крови не отличался от такового у контрольных мышей, которым вводили дистиллированную воду. Тем не менее взаимодействие факторов (F₃₆, = 4,65; р < 0,01) при проведении двухфакторного анализа (дозы препарата и присутствие самки за перегородкой) показало разное влияние ондансетрона на уровень гормона в присутствии и в отсутствие самки. Однофакторный дисперсионный анализ выявил влияние препарата на исходный уровень тестостерона (F₃₃₄ = 3,07; р < 0,05) и его отсутствие при предъявлении самки. Повышая исходный уровень гормонов в крови, меньшие дозы ондансетрона одновременно блокировали активирующий эффект рецептивной самки (см. таблицу).

Таким образом, антагонисты и агонисты 5 из 6 изученных подтипов 5-НТ-рецепторов существенно влияли на экспрессию вызываемой рецепторной самкой половой активации самцов. При этом разные типы и даже подтипы одного и того же типа 5- НТ-рецепторов оказывали на индуцируемую рецептивной самкой активацию ГГСК различное, как ингибирующее, так и активирующее, действие. Блокирование активации ГГСК, вызываемое присутствием самки, реализуется, по-видимому, с вовлечением 5-НТ_|а- и 5-НТ_2С-рецепторов, активация - с участием 5-НТтд- и 5-НТ₃-типов рецепторов. Эти результаты дают основание полагать существование реципрокной регуляции половой активации самцов, осуществляемой различного типа 5-НТ-рецепторами в пределах серотонинергической системы мозга.

Полученные данные привлекают внимание к агонистам и антагонистам разных типов 5-НТ-рецепторов как к возможным препаратам, которые могут быть использованы для фармакологической коррекции гормональных нарушений половой активации, тем более что некоторые из этих препаратов уже нашли клиническое применение. Так, агонисты 5-НТ_|А-рецепторов широко используются при лечении депрессий и тревожности.

Выводы

1. Серотониновые рецепторы вовлечены в регуляцию половой активации самцов мышей.
2. Разные типы и подтипы 5-НТ-рецепторов оказывают различное, как ингибирующее, так и активирующее, действие на вызываемую присутствием рецепторной самки активацию ГГСК самцов.