Определение аутоантител к антигенам поджелудочной железы у больных сахарным диабетом типа 1 и детей из групп риска

Разработка методов ранней диагностики доклинических форм инсулинзависимого сахарного диабета (ИЗСД) является одной из важнейших проблем современной эндокринологии. Исследования последних лет показали, что снижение или полное прекращение секреции инсулина, являющееся причиной заболевания, обусловлено деструкцией р-клеток островков Лангерганса поджелудочной железы человека в результате аутоиммунного процесса (14]. Обнаружение аутоантител к различным белкам (3-клеток является на сегодняшний день наиболее изученным иммунологическим феноменом, характерным для ИЗСД. Впервые антитела к антигенам клеток островков Лангерганса были обнаружены в 1974 г. G. Bottazzo и соавт. в сыворотках больных ИЗСД в комбинации с другими эндокринопатиями с помощью метода непрямой иммунофлюоресценции (НИФ) на срезах поджелудочной железы |4]. Далее было показано, что антитела к антигенам поджелудочной железы, а точнее — к цитоплазматическим компонентам клеток островков Лангерганса (ICA — islet cell antibodies), являются высокоспецифичным маркером аутоиммунного процесса при ИЗСД [3, 6, 7]. Метод определения ICA нашел широкое применение в клинической практике многих стран мира. Особенно перспективным оказалось использование ICA в качестве серологического маркера аутоиммунного процесса с целью выявления лиц с повышенным риском заболевания ИЗСД и их последующего мониторинга среди родственников больных ИЗСД, а также в некоторых других группах |2, 7, И, 15]. В ходе многолетних исследований в рамках программ по изучению диабета, ведущихся в разных странах Европы и Америки, была доказана высокая значимость этого показателя в отношении прогноза ИЗСД. В России до последнего времени метод определения ICA не применялся. Целью настоящей работы явилось совершенствование методики и определение 1СА в группах больных ИЗСД, среди родственников I степени родства больных ИЗСД (без клинической симптоматики) и лиц с нарушениями углеводного обмена.

Материалы и методы

Определение ICA было проведено у 298 детей. В 1-ю группу вошли дети с впервые диагностированным ИЗСД. Группа включала 36 детей в возрасте от 1 года до 13 лет (средний возраст 9,3 года), из них 36% мальчиков. Во 2-ю группу вошли сиблинги (родные братья и сестры) больных ИЗСД (104 ребенка от 2 до 17 лет, средний возраст 11,0 лет, из них 43% мальчиков), в 3-ю группу — дети, один из родителей которых болен ИЗСД (108 детей от 2 до 17 лет, средний возраст 9,7 года, 51% мальчиков). В 4-ю группу вошли 50 детей с нарушениями углеводного обмена, не имеющие близких родственников, страдающих ИЗСД, и состоящие на диспансерном учете у врача-эндокринолога в детских поликлиниках Санкт-Петербурга. Возраст детей в группе варьировал от 5 до 15 лет (в среднем 11,7 года; 60% мальчиков). У 42 детей отклонения от нормы были выявлены при проведении стандартной пробы на толерантность к глюкозе (СПТГ), из них 29 детям по результатам СПТГ и в соответствии с критериями, рекомендованными ВОЗ (1985), поставлен диагноз нарушения толерантности к глюкозе. У 13 детей при нормальном уровне глюкозы в крови натощак и через 2 ч после стандартной нагрузки было отмечено существенное (от 9 до 11,1 ммоль/л) повышение концентрации глюкозы в капиллярной крови через 1 ч после нагрузки. Как минимум однократное повышение концентрации глюкозы натощак (> 5,6 ммоль/л) было зафиксировано у 22 детей. У 6 детей этой группы СПТГ не проводили в связи с высокими показателями уровня глюкозы в крови натощак. Дневные колебания глюкозы в крови без специальной нагрузки находились у них в пределах нормы. У 2 детей повышение гликемии носило транзиторный характер, и СПТГ в период обследования соответствовала норме.

ICA определяли методом НИФ на срезах поджелудочной железы [4]. Для приготовления криостатных срезов использовали образцы ткани хвостовой части поджелудочной железы человека 0(1) группы крови. Поджелудочную железу брали от лиц, погибших от тяжелой механической травмы, не совместимой с жизнью, в сроки от 40 мин до 22 ч с момента смерти. Возраст пострадавших колебался от 20 до 70 лет, макроскопические признаки патологии поджелудочной железы у них отсутствовали.

Для приготовления криостатных срезов использовали фрагменты поджелудочной железы размером 1x1x0,5 см, толщина срезов составляла 4—5 мкм. Приготовленные срезы, прикрепленные к предметным стеклам, хранили при —20°С.

Для определения морфологической структуры и наличия островков Лангерганса по одному срезу от каждого образца ткани фиксировали в 10% забуференном формалине, отмывали дистиллированной водой и окрашивали гематоксилином и эозином.

Перед проведением НИФ криостатные срезы высушивали при комнатной температуре под струей воздуха в течение 1,5 ч. Затем на поверхность среза наносили исследуемую сыворотку в объеме 25 мкл и инкубировали во влажной камере при комнатной температуре в течение 30 мин. Далее стекла на 10 мин погружали в фосфатно-солевой буфер pH 7,3. После отмывания избыток влаги удаляли фильтровальной бумагой и на срезы наносили по 25 мкл раствора FlTC-меченных антител к IgG человека (30 мин, комнатная температура). Для отработки наиболее чувствительного варианта НИФ проводили сравнительный анализ различных конъюгатов антивидовых антител. Использовали козьи поликлональные FITC-меченные антитела к IgG человека, специфичные к Fabили Fc-фрагментам — FITC-Fab и FITc-Fc соответственно ("Sigma"), а также кроличьи поликлональные FITC-меченные антитела к IgG человека, специфичные к у-цепи — FITC-y ("Dako"). По окончании инкубации срезы еще раз отмывали (10 мин, фосфатно-солевой буфер), накрывали покровными стеклами и учитывали результаты (люминесцентный микроскоп МЛ-2, Россия; ув. 200). Все исследуемые сыворотки при первичном анализе использовали в цельном виде и в разведении 1:2. Позитивные сыворотки анализировали повторно титрованием до 1:512 для определения уровня ICA.B каждый опыт вводили референспозитивные и референс-негативные сыворотки, любезно предоставленные сотрудниками Отделения педиатрии Университета г. Оулу (Финляндия), а также ряд сывороток от больных ИЗСД и родственников больных ИЗСД, откалиброванных в соответствии с международными референс-стандартами (Juvenile Diabetes Foundation Standard). Результаты титрования выражали в JDFU (Juvenile Diabetes Foundation Units) согласно рекомендациям [5].

Результаты и их обсуждение

Приготовление срезов поджелудочной железы с неповрежденной структурой белковых молекул, служащих мишенями для аутоантител при ИЗСД, является принципиальным моментом для ICA-детекции. Ранее было показано, что использование стандартных приемов фиксации ткани с помощью этанола, метанола, формальдегида и ацетона нецелесообразно, так как эти реагенты изменяют конформацию крайне лабильных молекул-мишеней, в результате чего они утрачивают способность к взаимодействию с антителами. В настоящее время для определения ICA рекомендуется использование нефиксированных криостатных срезов поджелудочной железы [1, 10]. В результате исследования режимов замораживания и хранения ткани поджелудочной железы было показано, что для приготовления срезов требуемого качества необходимо использовать материал, замороженный в жидком азоте (—196°С) немедленно после извлечения. Хранение ткани перед замораживанием при 4°С в течение 2— 4 ч приводило к ее деструкции в результате аутолиза, что делало невозможным приготовление срезов или приводило к полной потере чувствительности теста НИФ в результате инактивации антигенов р-клеток. Срезы, приготовленные из немедленно замороженных образцов, отличались высоким качеством с точки зрения морфологии. Чувствительность НИФ снижалась также при использовании железы от пожилых людей или в случае длительного периода посмертной ишемии ткани. Таким образом, качество срезов, используемых для ICA-детекции, зависит от способа замораживания образцов, возраста донора и времени ишемии ткани, что согласуется с ранее представленными данными [10].

С целью выбора оптимальной для НИФ чувствительности мы провели сравнительный анализ трех вариантов антивидовых флюоресцирующих антител (см. раздел "Материалы и методы"). Все антитела были исследованы параллельно с 8 образцами негативных (К—) и 8 образцами позитивных контрольных сывороток (К.+). Ложноположительные результаты в реакции с Котсутствовали при использовании всех трех видов антител. Антитела FITC-Fc и FITC-y дали положительную реакцию со всеми образцами К+, однако интенсивность окраски антителами FITC-Fc была несколько выше (см. рисунок). В реакции с антителами FITC-Fab

Типичная иммунофлюоресценция клеток островков Лангерганса при обработке срезов поджелудочной железы человека 0(1) группы крови: а — сывороткой от больного ИЗСД с последующей окраской антивидовым FITCконъюгатом к Fc-фрагменту IgG человека; б — сывороткой здорового ребенка. У в. 200.

было выявлено только 3 из 8 К+. Полученные результаты вполне удовлетворительно можно объяснить большей доступностью Fc-фрагмента молекул ICA к взаимодействию с FITC-конъюгатами по сравнению с Fab-фрагментами, задействованными на этапе специфического взаимодействия с антигенами рклеток. Таким образом, для дальнейшей работы по детекции ICA рекомендовано использование антител к Fc-фрагменту или у-цепи молекулы IgG.

Определение ICA в различных группах детей дало следующие результаты. Большинство больных детей (83,3%) с впервые клинически установленным диагнозом ИЗСД (1-я группа) оказались ICAпозитивными (см. таблицу), что коррелирует с ранее опубликованными данными, согласно которым ICA определяются у 60—85% больных ИЗСД в раннем периоде заболевания [2, 3, 15]. Уровень 1СА у больных 1-й группы варьировал от 5 до 436 JDFU, составляя в среднем 55 JDFU. У части больных (16,7%) 1СА не были выявлены. Ранее было высказано предположение о том, что отсутствие ICA у больных ИЗСД может быть обусловлено либо тем, что к моменту клинического проявления заболевания у некоторых индивидуумов они уже исчезают,

Определение ICA у больных ИЗСД, родственников больных ИЗСД и лиц с нарушениями углеводного обмена

Примечание. * — указан средний геометрический титр; в скобках — диапазон колебаний титров.

либо наличием форм ИЗСД, протекающих без появления 1СА [15].

У здоровых индивидуумов ICA встречаются только в 0,2—4% случаев [3, 5]. Более высокая встречаемость ICA (в пределах 5—8%) была зарегистрирована у родственников 1 степени родства больных ИЗСД [2, 6, 7, 15]. Длительные наблюдения показали, что риск развития ИЗСД у этой категории лиц составляет 40—50% в течение ближайших 10 лет и зависит от возраста индивидуума и уровня ICA [2, 3, 7].

Согласно результатам наших исследований, 1САпозитивными оказались 15,4% сиблингов больных ИЗСД и 8,3% детей, имеющих одного из родителей, больных ИЗСД, т. е. встречаемость антител среди родных братьев и сестер больных диабетом в 2 раза превысила результаты, полученные в группе детей от больных родителей. Более частое появление ICA у сиблингов, чем у других родственников I степени родства больных ИЗСД, уже отмечалось ранее в ходе анализа результатов семейных исследований [12]. Средний уровень ICA в группах был практически одинаков, составляя 12 (сиблинги) и 13 (дети) JDFU и достигая у некоторых детей весьма высоких значений, свидетельствующих о высоком риске развития у них диабета. Вызывает интерес тот факт, что в обеих группах встречаемость ICA превышает аналогичные показатели, полученные в других странах. Необходимо отметить, что, согласно опубликованным данным по некоторым странам Европы, ИЗСД развивается в зависимости от длительности периода наблюдений в среднем у 6—9% родственников I степени родства больных диабетом типа 1 [9], т. е. процент заболевших примерно соответствует уровню ICA-позитивности. В Санкт-Петербурге подобной статистики до последнего времени не велось. В общей же популяции де• тей в течение последних лет отмечается устойчивая тенденция к росту заболеваемости ИЗСД. Так, за последние 2 года (1997 и 1998 гг.) в возрастной группе от 0 до 15 лет она повысилась с 10,6 до 12,3 случая на 100 000 населения соответствующего возраста. Не исключено, что высокая частота обнаружения аутоантител в группе родственников больных ИЗСД в исследуемом регионе может косвенно указывать либо на усиление действия диабетогенных факторов, либо на увеличение в популяции лице генетически высокой предрасположенностью к этому заболеванию.

В связи с вышеизложенным большой интерес вызывает поиск групп риска развития ИЗСД среди лиц, не имеющих близких родственников, страдающих этим заболеванием. В настоящее время в мире активно ведется поиск четких критериев оценки риска развития ИЗСД в обшей популяции. Несмотря на то что, как было установлено, прогностическая ценность определения 1СА в общей популяции имеет более ограниченное значение, чем для родственников больных ИЗСД, однако в сочетании с оценкой параметров углеводного обмена и выявлением генетической предрасположенности дает определенную информацию о риске развития заболевания [13]. В наших исследованиях высокий процент встречаемости (16%) антител был обнаружен у детей с различными нарушениями углеводного обмена (см. таблицу). Средняя величина ICA составила у них 10 JDFU, варьируя в пределах от 8 до 28 JDFU. При этом исследуемые антитела чаще выявлялись у детей с повышенным уровнем сахара в крови натощак. Так, в группе из 22 детей с уровнем глюкозы в цельной капиллярной крови в среднем 6,7 ± 0,32 ммоль/л 1СА выявлены в 22,7% случаев, а в группе детей, у которых повышение уровня сахара в крови натощак не было зафиксировано (28 человек), — только в 10,7% случаев. При этом уровень ICA в группах составил в среднем 11 и 8 JDFU соответственно (см. таблицу). Для адекватной оценки полученных нами данных необходимо дальнейшее наблюдение за детьми и проведение ряда дополнительных обследований.

Таким образом, в результате проведенных исследований выявлены группы лиц, имеющих высокий риск развития ИЗСД. Необходимо осуществление мониторинга динамики аутоиммунного процесса у этих детей, определение генетических маркеров риска ИЗСД (для повышения точности прогноза), а также применение лечебно-профилактических средств, таких как никотинамид, малые дозы инсулина и др., препятствующих прогрессирующему развитию диабета, широко изучаемых в рамках специальных международных программ [11]. Кроме того, необходимо выяснить причины высокой частоты обнаружения ICA у родственников больных ИЗСД в Санкт-Петербурге.

Выводы

1. Выявлен ряд критических параметров, определяющих результативность определения ICA (возраст донора ткани поджелудочной железы, условия ее хранения, эпитопная направленность антивидовых конъюгатов).
2. ICA обнаружены у большинства больных детей с впервые диагностированным ИЗСД.
3. Установлено, что частота регистрации ICA среди родственников 1 степени родства больных ИЗСД в Санкт-Петербурге превышает аналогичные показатели по высокоразвитым странам в 1,5—2 раза.
4. Среди детей с нарушениями углеводного обмена выявлена группа ICA-позитивных лиц.
5. На основании проведенных исследований выявлена группа лиц, имеющих высокий риск развития ИЗСД.