Влияние витамина Е на развитие нефропатии у кроликов с дитизоновым диабетом

В настоящее время приблизительно у 35% больных инсулинзависимым сахарным диабетом (тип 1) и у 15% пациентов с инсулиннезависимой формой заболевания (тип 2) развивается одно из самых серьезных микрососудистых осложнений — диабетическая нефропатия [17]. Это клинический синдром, который характеризуется стойкой альбуминурией, ранним повышением артериального давления, неуклонным снижением уровня клубочковой фильтрации и высоким риском инвалидизации и смертности вследствие сердечнососудистой патологии [20].

Одним из патофизиологических звеньев между гипергликемией и развитием дисфункции эндотелия является повышенное образование кислородсодержащих свободных радикалов, которое возникает вследствие трех процессов: аутоокисления глюкозы, неферментативного гликозилирования и гипоксии |21|. Являясь высокоактивными окислителями, свободные радикалы дают цитотоксический эффект, поскольку вызывают денатурацию, связывание и агрегацию белков, а также окисление липидов с образованием их перекисей (15]. В нормальных условиях свободные радикалы быстро элиминируются природными жирои водорастворимыми антиоксидантами. Однако у больных сахарным диабетом уровень естественных антиокислителей существенно снижен, что приводит к патологическому повышению количества реактивных радикалов, или так называемому "оксидативному стрессу" [8]. Причиной этого может быть повышенное потребление НАДФН в результате активации альдозоредуктазы, что приводит к истощению восстановленной формы этого кофермента, необходимого для регенерации таких антиоксидантов, как глутатион, витамины С и Е ] 19].

Исследования на крысах и кроликах с абсолютной инсулиновой недостаточностью выявили существенное повышение маркеров "оксидативного стресса" на ранних стадиях диабетической нефропатии по сравнению с контролем [13, 14]. В то же время было показано, что применение антиоксидантных витаминов С и Е способствует снижению выраженности микроальбуминурии и нефромегалии у экспериментальных животных [11].

Исходя из патогенетически обоснованной целесообразности использования антиоксидантов для предупреждения или ослабления диабетических микроангиопатий, целью настоящей работы явилось исследование влияния витамина Е на развитие нефропатии у кроликов с абсолютной инсулиновой недостаточностью.

Материалы и методы

Абсолютную инсулиновую недостаточность прямого р-цитотоксического генеза вызывали путем внутривенной инъекции дитизона (35 мг на 1 кг массы тела) самцам кроликов породы шиншилла массой 2,5—3 кг ] 18].

Обработку диабетических животных витамином Е начинали через 2 мес после индукции диабета, т. е. на стадии формирования микрососудистой патологии. Витамин Е (tocoferoli acetatas фирмы "Словакофарма") применяли перорально в виде желатиновых капсул по 100 мг на кролика ежедневно в течение 2 мес. Группа контрольных диабетических животных по аналогичной схеме получала плацебо.

Оценку глюкозного гомеостаза проводили ежемесячно по уровню базальной гликемии и инсулинемии, а также во время внутривенного теста толерантности к глюкозе (2 г/кг). Содержание глюкозы в крови определяли глюкозооксидазным методом с помощью ферментативного анализатора глюкозы "Ексан-Г" (Литва). Инсулинемию оценивали радиоиммунологическим методом "двойных антител" с использованием наборов "Беларис".

Величины интегральной гликемии и инсулинемии рассчитывали, суммируя показатели во всех временных точках исследования (0, 3, 5, 10, 30, 60 мин) при проведении внутривенного теста толерантности к глюкозе [10].

Состояние липидного обмена у экспериментальных животных характеризовали, определяя содержание диеновых конъюгатов [4], общего холестерина и p-липопротеидов в сыворотке крови [3].

Концентрацию альбумина в суточной моче определяли с помощью иммуноферментного анализа [6].

С целью верификации микрососудистой патологии в почках проводили гистологическое исследование с помощью электронной микроскопии. Кусочки ткани фиксировали в 2% растворе четырехокиси осмия, приготовленном на фосфатном буфере (pH 7,36). Материал обезвоживали в спиртах растущих концентраций и в абсолютном ацетоне и заливали в эпон-эралдин. Блоки ткани резали на ультрамикротоме LKB "NOVA". Ультратонкие срезы (300—400 А) окрашивали насыщенным водным раствором уранилацетата и раствором цитрата свинца. Исследование ультраструктуры и фотографирование препаратов проводили на электронном микроскопе УЭМБ-100К. Толщину гломерулярной базальной мембраны определяли по методу Hirose и соавт. [12].

Цифровой материал обрабатывали статистически с применением параметрического критерия Стьюдента [5] и непараметрического критерия Вилкоксона [1].

Результаты и их обсуждение

Исследования проводили на модели абсолютной инсулиновой недостаточности, которая возникает вследствие образования дитизоном токсических комплексов с цинком, что вызывает деструктивные изменения в панкреатических (3-клетках [18].

В результате проведенного эксперимента установлено, что уже через 1 сут после введения дитизона у кроликов, которые получали плацебо, отмечается повышение концентрации сахара в крови, которое сохраняется в течение 4 мес эксперимента (рис. 1). Применение витамина Е в течение 2 мес, которое начинали через 2 мес после индукции диа-

Рис. I. Динамика базальной гликемии у кроликов с дитизоновым диабетом, получавших витамин Е или плацебо, начиная со 2-го месяца после инъекции дитизона (X ± 5,).

По оси ординат — концентрация глюкозы (в ммоль/л); по оси абсцисс — временные интервалы исследования (в мес).

Здесь и на рис. 2, 3: / — интактный контроль (/» = 6); 2 — диабет 4плацебо (л = 8); 3 — диабет + витамин Е (п = 8).

• — отклонение достоверно по сравнению с интактным контролем (р < 0,05); ** — отклонение достоверно по сравнению с группой диабет + плацебо (р < 0,05).

Рис. 2. Динамика гликемии во время теста толерантности к глюкозе (2 г/кг внутривенно) у кроликов с дитизоновым диабетом, получавших витамин Е или плацебо в течение 2 мес (Х± 5,).

По оси ординат — концентрацию глюкозы (в ммоль/л); по оси абсцисс — время взятия сыворотки крови (в мин).

бета, приводило к достоверному снижению базальной гипергликемии, составляющему около 35% от исходного уровня до лечения. Подтверждением ослабления инсулиновой недостаточности у диабетических животных, получавших витамин Е, было также снижение гипергликемической реакции на нагрузку глюкозой (рис. 2) и повышение базальной и интегральной инсулинемии (рис. 3) относительно диабетического контроля.

В настоящее время существуют сведения о том, что концентрация таких первичных продуктов перекисного окисления липидов, как диеновые конъюгаты, значительно выше в сыворотке крови у пациентов с диабетическими микроангиопатиями, чем у больных без сосудистых осложнений [2]. Как свидетельствуют полученные результаты (табл. 1), через 4 мес после индукции диабета у животных, получавших плацебо, отмечается 5-кратное увеличение концентрации диеновых конъюгатов в сыворотке крови, в то время как применение витамина Е способствовало существенному снижению выше-

_i_____ 1______ I_______ I_________ I------- 1------------- 1---------- 1----------------------------- 1---------- 1

5       70      75       2 0 25              30 35             4 0        4 5       5 0       55       60

Рис. 3. Динамика инсулинемии во время теста толерантности к глюкозе (2 г/кг внутривенно) у кроликов с дитизоновым диабетом, получавших витамин Е или плацебо в течение 2 мес (% ± 5_Л).

По оси ординат — концентрация инсулина (в лмоль/л); по оси абсцисс — время взятия сыворотки крови (в мин).

указанного показателя. Кроме того, у этой группы животных наблюдали нормализацию повышенного дитизоном уровня холестерина и [З-липопротеидов в сыворотке крови кроликов (см. табл. 1).

Одним из ранних признаков клинической диабетической нефропатии и сердечно-сосудистой патологии у больных сахарным диабетом является микроальбуминурия (содержание альбумина в моче в пределах 30—300 мг/сут). Увеличение проницаемости клубочковых капилляров возникает вследствие роста гломерулярного давления и изменений толщины и заряда базальной мембраны [16]. Как видно из результатов, приведенных в табл. 2, через 4 мес после инъекции дитизона у диабетического контроля отмечается экскреция альбумина с мочой, что является подтверждением развития ранней стадии диабетической нефропатии. В то же время применение витамина Е в течение 2 мес вызывало снижение выраженности микроальбуминурии по сравнению с контрольной диабетической группой.

Таблица I

Показатели липидного обмена в сыворотке крови кроликов с дитизоновым диабетом, получавших витамин Е и плацебо в течение 2 мес (Х± У,)

Примечание. Здесь и в табл. 2: звездочки — достоверность (р < 0,05) различий: одна — с группой интактного контроля, две — с группой "диабет + плацебо".

Таблица 2

Некоторые показатели структурного и функционального состояния почки у кроликов с дитизоновым диабетом, получавших витамин Е и плацебо в течение 2 мес (X ± 5Д

Исследованиями последних лет показано, что у больных сахарным диабетом с микроальбуминурией размер почки увеличен относительно пациентов с нормоальбуминурией. Развитие нефромегалии непосредственно зависит от качества гликемического контроля и объясняется утолщением базальной мембраны клубочковых капилляров и увеличением площади фильтрационной поверхности на ранних стадиях диабетической нефропатии [7]. В конце эксперимента в группе диабетического контроля наблюдали достоверное повышение абсолютной и относительной массы почки, тогда как применение витамина Е снижало степень нефромегалии (см. табл. 2).

Характерным морфологическим признаком диабетической нефропатии является утолщение базальной мембраны клубочковых капилляров, что является следствием изменения ее биохимического состава [9]. Гистологический анализ почки подтвердил наличие ультраструктурных изменений, которые приводили к функциональным нарушениям у кроликов через 16 нед после индукции диабета, о чем свидетельствовало 2-кратное увеличение толщины гломерулярной базальной мембраны (см. табл. 2). При этом изучаемый показатель был снижен у животных, получавших витамин Е, хотя и оставался выше нормы.

Выводы

1. Пероральное использование витамина Е в течение 2 мес тормозит развитие диабетической нефропатии у кроликов с дитизоновым диабетом, что проявляется в снижении микроальбуминурии, массы почки и толщины гломерулярной базальной мембраны.
2. Ангиопротекторный эффект витамина Е, который реализуется за счет улучшения глюкозного гомеостаза и липидного обмена, обосновывает целесообразность его использования для предупреждения или ослабления клинической нефропатии у больных сахарным диабетом.