Preview

Проблемы Эндокринологии

Расширенный поиск

Кинетические параметры рецепторного связывания ГАМК мембранами аденогипофиза крыс в условиях моделирования различных уровней кортикостероидов и АКГТ в организме

https://doi.org/10.14341/probl11949

Полный текст:

Аннотация

Кинетические параметры специфического связывания l4C-ГАМК плазматическими мембранами аденогипофиза у крыс изучали в экспериментах по моделированию различных уровней кортикостероидов и АКТГ в организме животных. Одна инъекция гидрокортизона не изменила Ka для рецепторов ГАМК с высоким и низким сродством, число первых (Bmax) в этом случае возрастало. Повторные инъекции гидрокортизона были связаны со снижением Ко для высокоаффинных ГАМК-рецепторов и заметным увеличением Kn для низкоаффинных рецепторов с уменьшением их количества. Инъекция АКТГ не изменяла кинетические параметры связывания ГАМК с рецепторами. Количество высокоаффинных ГАМК-рецепторов и их аффинность уменьшались после удаления надпочечников, тогда как число низкоаффинных рецепторов в этом случае увеличивалось. Одна инъекция гидрокортизона крысам с адреналэктомией оказывала нормализующее действие на аденогипофизарные ГАМК-рецепторы. Анализ результатов и изменений гормонального уровня в крови показал, что аффинные изменения в высокоаффинных рецепторах и изменение количества низкоаффинных аденогипофизарных ГАМК-рецепторов коррелировали с изменениями в АКТГ и изменениями гидрокортизона.

Для цитирования:


Мишунина Т.М., Кононенко В.Я. Кинетические параметры рецепторного связывания ГАМК мембранами аденогипофиза крыс в условиях моделирования различных уровней кортикостероидов и АКГТ в организме. Проблемы Эндокринологии. 1993;39(6):43-46. https://doi.org/10.14341/probl11949

For citation:


Mishunina T.M., Kononenko V.Y. Kinetic parameters of GABA receptor binding by rat adenohypophysis membranes under conditions of modeling various levels of corticosteroids and ACGT in the body. Problems of Endocrinology. 1993;39(6):43-46. (In Russ.) https://doi.org/10.14341/probl11949

Несмотря на то что факт участия гамма- аминомасляной кислоты (ГАМК) в регуляции секреции АКТГ можно считать доказанным, многие вопросы, относящиеся к механизмам реализации ингибиторного ГАМК-ергического контроля функции гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой системы (ГГНС), остаются невыясненными. Один из них — вопрос о роли ГАМК в процессах регуляции секреции АКТГ кортикостероидами по принципу обратной связи. Предполагают, что кортикостероиды могут ингибировать секрецию АКТГ, изменяя синтез ГАМК [8]. Ранее нами при экспериментальном моделировании различного уровня кортикостероидов и АКТГ в организме крыс было показано изменение синтеза, метаболизма, а также транспорта медиатора си- наптосомами гипоталамуса [4, 5], что, несомненно, играет определенную роль в процессах регуляции кортикостероидами секреции АКТГ на уровне гипоталамуса. Особое значение при этом имеет состояние рецепторов ГАМК с учетом их центральной роли в молекулярных механизмах гуморальной регуляции физиологических процессов [7]. Установлено существенное влияние кортикостероидов и АКТГ на уровень специфического связывания 3Н-ГАМК синаптическими мембранами гипоталамуса [6]. Роль ГАМК-рецепторов аденогипофиза в механизмах регуляции кортикостероидами секреции АКТГ неизвестна.

Авторадиографическими, электрофизиологическими и фармакологическими исследованиями доказано присутствие ГАМК-рецепторов обоих типов (ГАМКЛ и ГАМКв) в аденогипофизе, изучаются их характеристики, влияние на экспрессию генов пролактина, участие в регуляции некоторых других гормонов аденогипофиза (гонадотропинов, соматотропина) [9].

Целью данной работы явилось исследование кинетических параметров специфического связывания |4С-ГАМК плазматическими мембранами аденогипофиза крыс при моделировании в организме животных различных уровней кортикостероидов и АКТГ.

Материалы и методы

Опыты проведены на крысах-самцах линии Вистар массой 180—200 г. Надпочечники удаляли у животных под эфирным наркозом за 8 дней до опыта. Гидрокортизон («Gedeon Richter», Венгрия) в дозе 5 мг на 100 г массы тела, кортикотропин и кортикотропин-цинк-фосфат (Каунасский завод эндокринных препаратов) в дозе 2,5 ЕД на 100 г массы тела вводили внутримышечно. Крыс декапитировали через 4 ч после однократного введения и через 24 ч после последней инъекции гормонов при многократном введении препаратов в течение 7 дней. Контролем служили ложноопе- рированные крысы и крысы, которым однократно или многократно вводили соответствующий объем физиологического раствора.

Для получения плазматических мембран использовали ткань аденогипофиза от 5—8 животных. Гомогенаты готовили в 50 мМ трис-цитратном буфере pH 7,1, центрифугировали при 40000 g в течение 20 мин (4 °C). Осадок мембран суспендировали в трис-цитратном буфере, замораживали при —20 °C; после оттаивания пробы центрифугировали при тех же условиях, трижды промывали с последующим осаждением и хранили при —20 °C. Осадок плазматических мембран перед использованием суспендировали в свежем буфере. Аликвоты (100 мкг белка) мембран инкубировали 15 мин при 0 °C в 50 мМ трис-цитратном буфере pH 7,1, содержащем различные концентрации |4С-ГАМК (1—512 пМ, удельная радиоактивность 200 Ku/мМ; «Amersham», Великобритания), используя пробирки фирмы «Beckman» (США). Реакцию останавливали центрифугированием проб в течение 10 мин при 40 000 g. Супернатант сливали, остаток жидкости тщательно удаляли фильтровальной бумагой, а к осадку приливали сцинтилляционную жидкость ЖС-8. Подсчет радиоактивности проводили на жидкостном сцинтилляционном счетчике LS 500 ТА («Beckman»). Специфическое связывание определяли как разницу между общим (в отсутствие ГАМК) и неспецифическим (в присутствии 10 3 М немеченой ГАМК) связыванием. Величины Kd и Вт рассчитывали, используя метод Корниш—Боуден [3]. При статистической обработке данных в качестве значения изучаемой величины рассматривали медиану |2|; сравнение парных рядов величин Kd и В,лах проводили методом критерия знаков [1]. Рассчитывали также величину эффективности связывания медиатора (Вп]ах:2К(d) [10] и коэффициент корреляции между изменениями уровня гормонов в крови и изменениями исследуемых кинетических параметров связывания меченой ГАМК |1].

Результаты и их обсуждение

При определении кинетических параметров специфического связывания |4С-ГАМК плазматическими мембранами аденогипофиза интактных крыс выявлены 2 популяции рецепторов соответственно с низким (K<j=20,0 пМ, Втах=1,36 пмоль на 1 мг белка) и высоким (Kd=0,92 пМ, Втах= = 1,77 пмоль на 1 мг белка) сродством к лиганду. Эффективность связывания медиатора рецепторами с низким сродством в 40 раз ниже таковой высокоаффинных рецепторов (соответственно 0,096 и 3,96).

Как видно из табл. 1, однократное введение гидрокортизона не изменяло для высоко-

Таблица 1

Кинетические параметры специфического связывания НС-ГАМК плазматическими мембранами аденогипофиза после адреналэктомии и введения гидрокортизона и АКТГ интактным и адреналэктомированным крысам

Условия эксперимента

Высокоаффинные ГАМК-рецепторы Kd |                 Вт.,'

Низкоаффинные ГАМК-рецепторы Kj | ДпаГ

Физиологический раствор, 4 ч

Г идрокортизон, 4 ч АКТГ, 4 ч

Физиологический раствор, 7 дней

Гидрокортизон, 7 дней

АКТГ, 7 дней

Ложная адреналэктомия

Адреналэктомия

Адреналэктомия гидрокортизон, 4 ч

0,87

1,12

24,4

1,45

0,98

3,73*

49,5

1,67

1,05

2,47

51,0

2,13

0,94

1,27

15,6

1,41

0,80*

1,88

347,3*

0,32*

1,37

1,74

32,0

1,76

0,97

2,91

20,0

1,22

5,13*

1,83*

16,1

2,09*

0,91**

2,06

17,0

0,85**

Примечание. Одна звездочка — р<0,05 по сравнению с соответствующим контролем, две — р<0,05 по сравнению с адреналэктомией.

и низкоаффинных ГАМК-рецепторов; количество первых (В|лах) при этом увеличивалось. Величина эффективности связывания для высокоаффинных ГАМК-рецепторов повышалась в 10 раз, для низкоаффинных снижалась в 1,5 раза (табл. 2). Многократное введение гидрокортизона сопровождалось снижением Ki Для высокоаффинных ГАМК-рецепторов и существенным (в 22 раза) повышением Ki Для низкоаффинных рецепторов. Количество последних при этом снижалось. Эффективность связывания для низкоаффинных ГАМК-рецепторов резко уменьшалась (в 423 раза), а для высокоаффинных увеличивалась в 2,6 раза. Введение АКТГ не изменяло величины кинетических параметров связывания ГАМК с рецепторами. Количество высокоаффинных ГАМК-рецепторов (В,пах) и их сродство (KJ снижались после удаления надпочечников, эффективность связывания изменялась незначительно. Количество низкоаффинных рецепторов и эффективность связывания ими ГАМК при этом повышались. Однократное вве-

Таблица 2

Эффективность связывания НС-ГАМК плазматическими мембранами аденогипофиза после адреналэктомии и введения гидрокортизона и АКТГ интактным и адреналэктомированным крысам (B^ax:Kd)

Условия эксперимента

Высокоаффинные ГАМК- рецепторы

Низкоаффинные

ГАМК рецепторы

Физиологический раствор, 4 ч

1,44

0,086

Гидрокортизон, 4 ч

14,20

0,056

АКТГ, 4 ч

5,81

0,089

Физиологический раствор, 7 дней

1,72

0,127

Гидрокортизон, 7 дней

4,42

0,0003

АКТГ, 7 дней

2,21

0,097

Ложная адреналэктомия

8,73

0,074

Адреналэктомия

6,53

0,270

Адреналэктомия+гидрокортизон,

4 ч

4,66

0,043

Корреляционная связь между изменениями содержания гормонов ГГНС в плазме крови и изменениями величин кинетических параметров рецепторного связывания '*С-ГАМК плазматическими мембранами аденогипофиза (коэффициент Спирмена)

Гормон

Высокоаффинные

ГАМК-рецепторы

Низкоаффинные ГАМК-рецепторы

Kd

^max

Kd

®niax

АКТГ

+0,886*

—0,486

—0,486

+0,771*

Кортизол

—0,943*

+0,600

+0,543

—0,886*

Корти-

костерон

—0,086

+0,604

—0,714

—0,143

Примечание. Звездочка — уровень корреляционной связи между сравниваемыми показателями статистически значим (р<0,05).

дение гидрокортизона адреналэктомированным крысам оказывало нормализующее действие на состояние ГАМК-рецепторов аденогипофиза.

При сопоставлении полученных результатов с изменениями уровня АКТГ, кортизола и кортикостерона в крови установлено [4], что изменение сродства высокоаффинных и количества низкоаффинных ГАМК-рецепторов аденогипофиза коррелировало с изменениями содержания АКТГ и кортизола (табл. 3).

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что ГАМК-рецепторы аденогипофиза, вероятно, принимают участие в механизмах регуляции кортикостероидами секреции АКТГ по типу обратной связи. Следует отметить, что повышение уровня АКТГ в организме после введения экзогенного гормона не влияло на кинетические параметры специфического связывания меченой ГАМК мембранами аденогипофиза, но изменение уровня эндогенного гормона связано с изменениями состояния рецепторов ГАМК. Предполагают, что в гипоталамусе состояние ГАМК-рецепторов в большей степени зависит от уровня АКТГ, чем от уровня кортикостероидов [6, 10], хотя в литературе это мнение дискутируется [11]. При этом общим можно считать вывод о том, что эффект как глюкокортикоидов, так и АКТГ обусловлен прямым аллостерическим действием гормонов на мембраны и модификацией сродства ГАМК-рецепторов к медиатору, характеризующейся к тому же выраженными регионарными различиями [11]. Это тем более интересно, что местом локализации глюкокортикоидных рецепторов на мембране нейрона является локус, принадлежащий олигомерному рецепторному комплексу ГАМК—бензодиазепин— С1 "-канал [13].

В аденогипофизе нами выявлены изменения не только сродства, но и количества ГАМК- рецепторов. Анализ полученных данных позволяет предположить, что кратковременное действие глюкокортикоидов затрагивает состояние высокоаффинных рецепторов, характер изменений которого предполагает активацию ГАМКергиче- ских механизмов торможения секреции АКТГ. При длительном избытке кортикостероидов в организме наряду с повышением сродства высокоаффинных ГАМК-рецепторов наблюдаются резкие изменения в состоянии низкоаффинных ГАМК-рецепторов. Связывание медиатора этим типом рецепторов практически отсутствует (см. табл. 2); возможно, такая реакция является компенсаторной, препятствующей глубокому тор- моржению функции ГГНС (уровень АКТГ снижается в этих условиях эксперимента почти в 6 раз [4]). При этом необходимо отметить, что в состав рецепторного комплекса ГАМК — бензодиазепин—С1~-канал входят преимущественно низкоаффинные ГАМК-рецепторы [12], роль которых в механизмах влияния кортикостероидов на мозг доказана [11]. В условиях адреналэктомии при низком уровне глюкокортикоидов в организме и высоком содержании АКТГ оба типа ГАМК-рецепторов реагируют изменением своего функционального состояния, причем направленность сдвигов для низко- и высокоаффинных рецепторов противоположна (см. табл. 1), что может свидетельствовать о различных функциях подтипов ГАМК-рецепторов в механизмах регуляции секреции АКТГ на уровне аденогипофиза.

Выводы

  1. Однократное введение гидрокортизона не изменяло сродство низко- и высокоаффинных ГАМК-рецепторов в аденогипофизе крыс; количество последних при этом увеличивалось.
  2. Многократное введение гидрокортизона сопровождалось повышением сродства высокоаффинных ГАМК-рецепторов и резким снижением сродства и количества низкоаффинных ГАМК- рецепторов аденогипофиза.
  3. Введение АКТГ не изменяло величину кинетических параметров связывания 14С-ГАМК с рецепторами аденогипофиза крыс.

Количество высокоаффинных ГАМК-рецепторов и их сродство снижались после удаления надпочечников; количество низкоаффинных рецепторов при этом повышалось. Однократное введение гидрокортизона адреналэктомированным крысам оказывало нормализующее действие на состояние ГАМК-рецепторов аденогипофиза крыс.

Список литературы

1. Кириаков Г. В., Никурадзе В. О., Рожанец В. В. Эффективность связывания — новый показатель для сравнения состояния рецепторов.— М., 1985. (Рукопись деп. в ВИНИТИ, № 6182—85 Деп.)

2. Лакин Г. Ф. Биометрия.— М., 1980,

3. Машилов К. В., Кириаков Г. В., Малин К. М. и др. // Бюл. экспер. биол.— 1987.— № 4.— С. 506—508.

4. Мишунина Т. М., Кононенко В. Я- // Укр. биохим. журн,— 1990,— Т. 62, № 6,— С. 71—79.

5. Мишунина Т. М„ Кононенко В. Я. // Докл. АН УССР.— 1990,— № 10,— С. 63—66.

6. Мишунина Т. М., Кононенко В. Я- // Бюл. экспер. биол.— 1991,— № 1,— С. 42—43.

7. Сергеев П. В., Шимановский Н. Л. Рецепторы физиологически активных веществ,— М., 1987.

8. Acs Z.. Stark Е. // J. Endocr.— 1978,— Vol. 77, N 1,— Р. 137—141.

9. Demeneix В., Feliz Р., Loeffler J. // GABAergic Mechanism in the Mammalian Periphery / Eds S. Erdo,N. Boery.— New York, 1986,— P. 261—289.

10. Kendal D., McEwen B., Enna S. // Brain Res.— 1982.— Vol. 236, N 2,— P. 365—374.

11. Majewska M., Bisserbe J.-C., Eskay R. // Ibid.— 1985.— Vol. 339, N 1,— P. 178—182.

12. Supaviali P., Cortes R., Palacios J. et al. // Modulation of Central and Peripheral Transmitter Function / Eds G. Biggio et al.— New York, 1986.— P. 453—457.

13. Sutanto W., Handelman G., De Kloet E. // Neuroendocr. Lett.— 1988,— Vol. 10, N 4,— P. 280


Об авторах

Т. М. Мишунина

НИИ эндокринологии и обмена веществ им. В. П. Комиссаренко Минздрава Украины


Украина


В. Я. Кононенко

НИИ эндокринологии и обмена веществ им. В. П. Комиссаренко Минздрава Украины


Украина


Рецензия

Для цитирования:


Мишунина Т.М., Кононенко В.Я. Кинетические параметры рецепторного связывания ГАМК мембранами аденогипофиза крыс в условиях моделирования различных уровней кортикостероидов и АКГТ в организме. Проблемы Эндокринологии. 1993;39(6):43-46. https://doi.org/10.14341/probl11949

For citation:


Mishunina T.M., Kononenko V.Y. Kinetic parameters of GABA receptor binding by rat adenohypophysis membranes under conditions of modeling various levels of corticosteroids and ACGT in the body. Problems of Endocrinology. 1993;39(6):43-46. (In Russ.) https://doi.org/10.14341/probl11949

Просмотров: 144


ISSN 0375-9660 (Print)
ISSN 2308-1430 (Online)