Кинетические параметры рецепторного связывания ГАМК мембранами аденогипофиза крыс в условиях моделирования различных уровней кортикостероидов и АКГТ в организме

Несмотря на то что факт участия гамма- аминомасляной кислоты (ГАМК) в регуляции секреции АКТГ можно считать доказанным, многие вопросы, относящиеся к механизмам реализации ингибиторного ГАМК-ергического контроля функции гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой системы (ГГНС), остаются невыясненными. Один из них — вопрос о роли ГАМК в процессах регуляции секреции АКТГ кортикостероидами по принципу обратной связи. Предполагают, что кортикостероиды могут ингибировать секрецию АКТГ, изменяя синтез ГАМК [8]. Ранее нами при экспериментальном моделировании различного уровня кортикостероидов и АКТГ в организме крыс было показано изменение синтеза, метаболизма, а также транспорта медиатора си- наптосомами гипоталамуса [4, 5], что, несомненно, играет определенную роль в процессах регуляции кортикостероидами секреции АКТГ на уровне гипоталамуса. Особое значение при этом имеет состояние рецепторов ГАМК с учетом их центральной роли в молекулярных механизмах гуморальной регуляции физиологических процессов [7]. Установлено существенное влияние кортикостероидов и АКТГ на уровень специфического связывания ³Н-ГАМК синаптическими мембранами гипоталамуса [6]. Роль ГАМК-рецепторов аденогипофиза в механизмах регуляции кортикостероидами секреции АКТГ неизвестна.

Авторадиографическими, электрофизиологическими и фармакологическими исследованиями доказано присутствие ГАМК-рецепторов обоих типов (ГАМК_Л и ГАМКв) в аденогипофизе, изучаются их характеристики, влияние на экспрессию генов пролактина, участие в регуляции некоторых других гормонов аденогипофиза (гонадотропинов, соматотропина) [9].

Целью данной работы явилось исследование кинетических параметров специфического связывания ^|4С-ГАМК плазматическими мембранами аденогипофиза крыс при моделировании в организме животных различных уровней кортикостероидов и АКТГ.

Материалы и методы

Опыты проведены на крысах-самцах линии Вистар массой 180—200 г. Надпочечники удаляли у животных под эфирным наркозом за 8 дней до опыта. Гидрокортизон («Gedeon Richter», Венгрия) в дозе 5 мг на 100 г массы тела, кортикотропин и кортикотропин-цинк-фосфат (Каунасский завод эндокринных препаратов) в дозе 2,5 ЕД на 100 г массы тела вводили внутримышечно. Крыс декапитировали через 4 ч после однократного введения и через 24 ч после последней инъекции гормонов при многократном введении препаратов в течение 7 дней. Контролем служили ложноопе- рированные крысы и крысы, которым однократно или многократно вводили соответствующий объем физиологического раствора.

Для получения плазматических мембран использовали ткань аденогипофиза от 5—8 животных. Гомогенаты готовили в 50 мМ трис-цитратном буфере pH 7,1, центрифугировали при 40000 g в течение 20 мин (4 °C). Осадок мембран суспендировали в трис-цитратном буфере, замораживали при —20 °C; после оттаивания пробы центрифугировали при тех же условиях, трижды промывали с последующим осаждением и хранили при —20 °C. Осадок плазматических мембран перед использованием суспендировали в свежем буфере. Аликвоты (100 мкг белка) мембран инкубировали 15 мин при 0 °C в 50 мМ трис-цитратном буфере pH 7,1, содержащем различные концентрации ^|4С-ГАМК (1—512 пМ, удельная радиоактивность 200 Ku/мМ; «Amersham», Великобритания), используя пробирки фирмы «Beckman» (США). Реакцию останавливали центрифугированием проб в течение 10 мин при 40 000 g. Супернатант сливали, остаток жидкости тщательно удаляли фильтровальной бумагой, а к осадку приливали сцинтилляционную жидкость ЖС-8. Подсчет радиоактивности проводили на жидкостном сцинтилляционном счетчике LS 500 ТА («Beckman»). Специфическое связывание определяли как разницу между общим (в отсутствие ГАМК) и неспецифическим (в присутствии 10 ³ М немеченой ГАМК) связыванием. Величины K_d и В_т рассчитывали, используя метод Корниш—Боуден [3]. При статистической обработке данных в качестве значения изучаемой величины рассматривали медиану |2|; сравнение парных рядов величин K_d и В,_лах проводили методом критерия знаков [1]. Рассчитывали также величину эффективности связывания медиатора (В_п]ах:²К(d) [10] и коэффициент корреляции между изменениями уровня гормонов в крови и изменениями исследуемых кинетических параметров связывания меченой ГАМК |1].

Результаты и их обсуждение

При определении кинетических параметров специфического связывания ^|4С-ГАМК плазматическими мембранами аденогипофиза интактных крыс выявлены 2 популяции рецепторов соответственно с низким (K<j=20,0 пМ, В_тах=1,36 пмоль на 1 мг белка) и высоким (K_d=0,92 пМ, В_тах= = 1,77 пмоль на 1 мг белка) сродством к лиганду. Эффективность связывания медиатора рецепторами с низким сродством в 40 раз ниже таковой высокоаффинных рецепторов (соответственно 0,096 и 3,96).

Как видно из табл. 1, однократное введение гидрокортизона не изменяло для высоко-

Таблица 1

Кинетические параметры специфического связывания ^НС-ГАМК плазматическими мембранами аденогипофиза после адреналэктомии и введения гидрокортизона и АКТГ интактным и адреналэктомированным крысам

Условия эксперимента

Высокоаффинные ГАМК-рецепторы Kd |                 Вт.,'

Низкоаффинные ГАМК-рецепторы Kj | ДпаГ

Физиологический раствор, 4 ч

Г идрокортизон, 4 ч АКТГ, 4 ч

Физиологический раствор, 7 дней

Гидрокортизон, 7 дней

АКТГ, 7 дней

Ложная адреналэктомия

Адреналэктомия

Адреналэктомия гидрокортизон, 4 ч

Примечание. Одна звездочка — р<0,05 по сравнению с соответствующим контролем, две — р<0,05 по сравнению с адреналэктомией.

и низкоаффинных ГАМК-рецепторов; количество первых (В_|лах) при этом увеличивалось. Величина эффективности связывания для высокоаффинных ГАМК-рецепторов повышалась в 10 раз, для низкоаффинных снижалась в 1,5 раза (табл. 2). Многократное введение гидрокортизона сопровождалось снижением Ki Для высокоаффинных ГАМК-рецепторов и существенным (в 22 раза) повышением Ki Для низкоаффинных рецепторов. Количество последних при этом снижалось. Эффективность связывания для низкоаффинных ГАМК-рецепторов резко уменьшалась (в 423 раза), а для высокоаффинных увеличивалась в 2,6 раза. Введение АКТГ не изменяло величины кинетических параметров связывания ГАМК с рецепторами. Количество высокоаффинных ГАМК-рецепторов (В,_пах) и их сродство (KJ снижались после удаления надпочечников, эффективность связывания изменялась незначительно. Количество низкоаффинных рецепторов и эффективность связывания ими ГАМК при этом повышались. Однократное вве-

Таблица 2

Эффективность связывания ^НС-ГАМК плазматическими мембранами аденогипофиза после адреналэктомии и введения гидрокортизона и АКТГ интактным и адреналэктомированным крысам (B^_ax:K_d)

Корреляционная связь между изменениями содержания гормонов ГГНС в плазме крови и изменениями величин кинетических параметров рецепторного связывания '*С-ГАМК плазматическими мембранами аденогипофиза (коэффициент Спирмена)

Примечание. Звездочка — уровень корреляционной связи между сравниваемыми показателями статистически значим (р<0,05).

дение гидрокортизона адреналэктомированным крысам оказывало нормализующее действие на состояние ГАМК-рецепторов аденогипофиза.

При сопоставлении полученных результатов с изменениями уровня АКТГ, кортизола и кортикостерона в крови установлено [4], что изменение сродства высокоаффинных и количества низкоаффинных ГАМК-рецепторов аденогипофиза коррелировало с изменениями содержания АКТГ и кортизола (табл. 3).

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что ГАМК-рецепторы аденогипофиза, вероятно, принимают участие в механизмах регуляции кортикостероидами секреции АКТГ по типу обратной связи. Следует отметить, что повышение уровня АКТГ в организме после введения экзогенного гормона не влияло на кинетические параметры специфического связывания меченой ГАМК мембранами аденогипофиза, но изменение уровня эндогенного гормона связано с изменениями состояния рецепторов ГАМК. Предполагают, что в гипоталамусе состояние ГАМК-рецепторов в большей степени зависит от уровня АКТГ, чем от уровня кортикостероидов [6, 10], хотя в литературе это мнение дискутируется [11]. При этом общим можно считать вывод о том, что эффект как глюкокортикоидов, так и АКТГ обусловлен прямым аллостерическим действием гормонов на мембраны и модификацией сродства ГАМК-рецепторов к медиатору, характеризующейся к тому же выраженными регионарными различиями [11]. Это тем более интересно, что местом локализации глюкокортикоидных рецепторов на мембране нейрона является локус, принадлежащий олигомерному рецепторному комплексу ГАМК—бензодиазепин— С1 "-канал [13].

В аденогипофизе нами выявлены изменения не только сродства, но и количества ГАМК- рецепторов. Анализ полученных данных позволяет предположить, что кратковременное действие глюкокортикоидов затрагивает состояние высокоаффинных рецепторов, характер изменений которого предполагает активацию ГАМКергиче- ских механизмов торможения секреции АКТГ. При длительном избытке кортикостероидов в организме наряду с повышением сродства высокоаффинных ГАМК-рецепторов наблюдаются резкие изменения в состоянии низкоаффинных ГАМК-рецепторов. Связывание медиатора этим типом рецепторов практически отсутствует (см. табл. 2); возможно, такая реакция является компенсаторной, препятствующей глубокому тор- моржению функции ГГНС (уровень АКТГ снижается в этих условиях эксперимента почти в 6 раз [4]). При этом необходимо отметить, что в состав рецепторного комплекса ГАМК — бензодиазепин—С1~-канал входят преимущественно низкоаффинные ГАМК-рецепторы [12], роль которых в механизмах влияния кортикостероидов на мозг доказана [11]. В условиях адреналэктомии при низком уровне глюкокортикоидов в организме и высоком содержании АКТГ оба типа ГАМК-рецепторов реагируют изменением своего функционального состояния, причем направленность сдвигов для низко- и высокоаффинных рецепторов противоположна (см. табл. 1), что может свидетельствовать о различных функциях подтипов ГАМК-рецепторов в механизмах регуляции секреции АКТГ на уровне аденогипофиза.

Выводы

1. Однократное введение гидрокортизона не изменяло сродство низко- и высокоаффинных ГАМК-рецепторов в аденогипофизе крыс; количество последних при этом увеличивалось.
2. Многократное введение гидрокортизона сопровождалось повышением сродства высокоаффинных ГАМК-рецепторов и резким снижением сродства и количества низкоаффинных ГАМК- рецепторов аденогипофиза.
3. Введение АКТГ не изменяло величину кинетических параметров связывания ¹⁴С-ГАМК с рецепторами аденогипофиза крыс.

Количество высокоаффинных ГАМК-рецепторов и их сродство снижались после удаления надпочечников; количество низкоаффинных рецепторов при этом повышалось. Однократное введение гидрокортизона адреналэктомированным крысам оказывало нормализующее действие на состояние ГАМК-рецепторов аденогипофиза крыс.