Действие соматотропина и непептидного митогенного фактора на пролиферативную активность тимоцитов

Гипофиз играет существенную роль в регенерации вилочковой железы [5, 8, 9], о чем свидетельствует инволюция тимуса, наступающая в результате гипофизэктомии [5, 8]. Известно также, что соматотропин (СТГ) ускоряет включение ³Н-тимидина в ДНК кортизончувствительной популяции тимоцитов [8]. Кроме того, введение СТГ способствует восстановлению нормальной структуры тимуса у гипофизэктомированных животных [5]. В то же время восстановление массы вилочковой железы и количества тимоцитов в ней, наступающее после введения гидрокортизона, происходит за счет пролиферации кортизонрезистентных, так называемых двойных отрицательных (СД4 , СД8 ) тимоцитов, не имеющих рецепторов для СТГ [4, 8, 9]. Ускорение регенерации вилочковой железы, уменьшенной в результате введения гидрокортизона, in vivo достигается также введением непептидного митогенного фактора (НМФ) [1]. Его митогенное действие на тимоциты сопряжено с внутри- и внеклеточным накоплением гипоксантина, который отменяет ограничение синтеза ДНК в тимоцитах, обусловленное относительным дефицитом пурин- нуклеозидфосфорилазной активности в этих клетках [7]. Аналогичное действие оказывает хорошо известный Т-клеточный поликлональный митоген — конканавалин А [2].

В настоящем исследовании мы попытались выяснить механизм действия СТГ на пуриновый метаболизм.

Материалы и методы

Опыты выполнены на крысах линии Wistar массой 180— 200 г. Для воспроизведения митогенного действия СТГ на неразделенные тимоциты крысы использовали СТГ быка, выделенный методом S. Ellis [3] и любезно предоставленный нам доктором мед. наук Ф. П. Мартыненко. О митогенном действии на тимоциты судили по включению ^|1С-тимидина в ДНК тимоцитов крысы [5, 8]. Влияние СТГ и НМФ на распределение ^иС-адениловой кислоты (АМ-2-Р) среди ее катаболитов изучали с помощью хроматографии на бумаге [||. Тимоциты 4-Ю⁷ инкубировали в 4 мл среды Хенкса, содержащей 0,175 мМ АМ-2-Р в течение 45 мин при 37 °C в присутствии 50 мкг НМФ или без него. Для исследования действия СТГ в инкубационную среду вводили 250 мкг гормона. Для изучения действия СТГ на кортизон- резистентную популяцию тимоцитов крысам Wistar вводили по 5 мг гидрокортизона в 1 мл 0,14 М NaCl в течение 2 дней, после чего извлекали тимус и выделяли тимоциты с помощью слабо притертого гомогенизатора Поттера Эльвейема.

После 45-минутной инкубации неразделенных (суммарных) или кортизонрезистентных тимоцитов в присутствии НМФ или СТГ клетки отмывали средой Хенкса и добавляли новую порцию среды, содержащую такое же количество НМФ или СТГ, и снова инкубировали. В контрольные пробы НМФ или СТГ не добавляли. Через 20, 40 и 60 мин отбирали по 1 мл суспензии, клетки отделяли центрифугированием при 1500 об/мин и отбирали надосадочную жидкость. К осадку добавляли адекватное количество среды. Клетки и надосадочную жидкость экстрагировали 4,2 М раствором хлорной кислоты (конечная концентрация 0,42 М), нейтрализовали экстракт 4.22 М КОН и осадок хлората калия удаляли центрифугированием. 50 мкл нейтрализованного экстракта наносили на бумагу FN-2 (ГДР), хроматографировали в системе растворителей ацетонитрил — 0,1 М ацетат аммония — аммиак (6:3:1) в присутствии свидетелей — АМФ, аденозина, гипоксантина, инозина и гуанозина [1]. Гуанозин отделяли от гипоксантина в системе растворителей ацетонитрил — 0,1 М ацетат аммония — уксусная кислота (60:30:2).

Результаты и их обсуждение

Инкубация неразделенных тимоцитов с СТГ (концентрация 50—400 мкг на 5- 10^е клеток в 1 мл) усиливает включение 2-^|4С-тимидина в ДНК кор-

Рис. 1. Влияние СТГ на включение 2-^|4С-тимидина в ДНК. суммарной (/) и кортизонрезистентной (2) популяции тимоцитов крыс. Время инкубации 4 ч.

По оси ординат (здесь и на рис. 2) — разница между уровнем включения метки в опыте и контроле (в имп/мин); по оси абсцисс — доза СТГ (в мкг на 10^е клеток).

Здесь и на рис. 2 достоверность различий между уровнем включения метки в опыте и контроле: одна звездочка—р<0,05, две —р<0,01, три - р<0,02.

Рис. 2_. Влияние гипоксантина на включение 2-'⁴С-тимидина в ДНК кортизонрезистентных тимоцитов мышей.

По оси абсцисс — доза гипоксантина (в мкг на IO^fi клеток).

тизонрезистентных тимоцитов. Максимальное включение тимидина наблюдалось при концентрации СТГ 100 мкг на 5-Ю⁶ клеток в I мл. Дальнейшее повышение концентрации гормона не увеличивает включение 2-^иС-тимидина в ДНК тимоцитов. На рис. 1-представлена разница между включением 2-^|4С-тимидина в ДНК тимоцитов в присутствии СТГ и без него. Результат практически не отличается от ранее представленного G. Talwar [8]. Однако под влиянием СТГ накопления гипоксантина, образующегося из АМ-2-Р, мы не наблюдали. Таким образом, увеличение включения 2-^|4С-тимидина в ДНК неразделенных тимоцитов непосредственно не связано с накоплением гипоксантина. В таблице представлен уровень гипоксантина в неразделенных тимоцитах при концентрациях СТГ, ускоряющих включение 2-'⁴С-ти- мидина в ДНК тимоцитов. Как и следовало ожидать, инкубация кортизонрезистентных тимоцитов с СТГ не приводит ни к ускорению включения 2-^|4С-тимидина в ДНК (см. рис. 1), ни к увеличению накопления гипоксантина (см. таблицу). В то же время накопление гипоксантина под влиянием НМФ, выделенного из вилочковой железы, наблюдается только при использовании гидрокортизонрезистентных тимоцитов. Инкубация гидрокортизонрезистентных тимоцитов с гипоксантином в концентрациях, встречающихся при стимуляции НМФ (25 мкг на 5-Ю⁶ клеток в 1 мл), вызывает увеличение включения 2-^|4С- тимидина в ДНК этих клеток (рис. 2). Это прямо указывает на то, что митогенное действие НМФ зависит от накопления гипоксантина, вызываемого этим фактором. Усиление накопления гипоксантина под влиянием НМФ также наблюдается только в случае использования кортизонрезистентных тимоцитов (см. таблицу).

Таким образом, объектом митогенного действия СТГ и НМФ являются совершенно разные популяции тимоцитов. Можно утверждать также, что и механизм увеличения включения тимидина в ДНК тимоцитов под влиянием СТГ отличается от такового под влиянием НМФ. Действительно, вызываемого НМФ накопления гипоксантина в кортизонрезистентных тимоцитах достаточно для ускорения и/или отмены ограничения синтеза ДНК, в этой популяции клеток, СТГ увеличивает включение тимидина в ДНК только кортизончувствительных клеток, не влияя при этом на уровень гипоксантина.

Представленные данные свидетельствуют о том, что регенерация вилочковой железы, по крайней мере, наступающая после введения гидрокортизона, происходит за счет разных источников и контролируется не единственным фактором. Известно, что быстрая инволюция вилочковой железы, наступающая после введения гидрокортизона млекопитающим, сопровождается энергичным размножением кортизонрезистентных субкапсулярных тимоцитов, несущих на поверхности Thy-1 антиген и не имеющих СД4 и СД8 антигенов. Принято считать, что восстановление массы и количества Т-клеток вилочковой железы происходит в основном за счет пролиферации именно этих клеток. Данные клетки чувствительны к токсическому действию дезоксигуанозина, который может накапливаться в них в силу особенного соотношения активности ферментов пуринового метаболизма и тормозить синтез ДНК [7]. Чувствительность этих клеток к дезоксигуанозину подавляется дезоксицитидином, который продуцируют и выделяют тимусные макрофаги. Активированные Т-лимфоциты периферической крови и медуллярные тимоциты, имеющие зрелый антигенный фенотип, также чувствительны к дезоксигуанозину, однако у этих клеток токсичность дезоксигуанозина и торможение синтеза ДНК подавляются гипоксантином, а не дезоксицитидином. Накопление гипоксантина кортизонрезистентными клетками в концентрациях, ускоряющих включение 2-^|4С-тимидина под влиянием НМФ, свидетельствует о том, что этот фактор действует на медуллярные кортизонрезистентные клетки зрелого фенотипа. Таким образом, регенерация вилочковой железы, уменьшенной после введения гидрокортизона, может происходить за счет

Влияние НМФ тимуса на включение ^|4С-АМ-2-Р во внеклеточный гипоксантин кортизонрезистентных тимоцитов и СТГ на включение во внеклеточный гипоксантин неразделенных тимоцитов крысы in vitro (имп/мин; п=5; \М±т)

Примечание. AM — разница между уровнем включения метки в опыте и контроле. Различия между контролем и опытом достоверны: одна звездочка — р<0,05; две — р<0,02; три — р<0,01.

пролиферации двух кортизонрезистентных популяций, контролируемых разными факторами. Пролиферация кортизончувствительных клеток, формирующихся из субкапсулярных СДЗ~, СД4“, СД8~ кортизонрезистентных клеток, контролируется СТГ [10].

Выводы

1. СТГ не оказывает влияния на кортизон- резистентные тимоциты, чувствительные к НМФ.
2. НМФ увеличивает накопление внутри- и внеклеточного гипоксантина в железе, что оказывает стимулирующее влияние на пролиферацию кортизонрезистентных тимоцитов.
3. Вызванное СТГ ускорение синтеза ДНК в кортикальных тимоцитах не связано с изменением концентрации внутри- и внеклеточного гипоксантина.