Транспорт витамина D3 через кишечник и его обмен в печени крыс при аллоксановом диабете

Сахарный диабет, возникновение которого связано с недостаточностью функции р-клеток поджелудочной железы, сопровождается нарушением многих видов обмена в организме [2, 4]. Исследования последних лет свидетельствуют также о взаимосвязи развития сахарного диабета и обмена витамина D. С одной стороны, показано, что сахарный диабет приводит к развитию диабетической остеопении, нарушению минерального гомеостаза, который проявляется не только снижением содержания минеральных компонентов в сыворотке крови, но и усилением экскреции кальция с мочой, ингибированием его активного транспорта через кишечник [5, 13]. Одной из возможных причин перечисленных нарушений при сахарном диабете может быть недостаточностью обеспечения организма активными метаболитами витамина D, хотя данные литературы по этому вопросу несколько противоречивы [9, 10]. Кроме того, имеются указания, что 1,25-дигидроксихоле- кальциферол регулирует рост, созревание и функциональную активность (-клеток поджелудочной железы [6, 7].

С другой стороны, инсулин оказывает прямое стимулирующее влияние на активность гидроксилаз витамина D в печени и почках [8, 111. Поэтому недостаточность инсулина может послужить причиной нарушения обмена витамина О в организме. Снижение обеспеченности организма витамином D в свою очередь может усугублять степень уменьшения содержания инсулина, так как известно, что у крыс с недостатком витамина О ингибируется секреция инсулина. Введение витамина О приводит к нормализации этого процесса [5, 12].

Возможными причинами недостаточности витамина D при диабете могут быть как нарушение транспорта холекальциферола через кишечник, так и нарушения процессов его гидроксилирования. В связи с этим целью настоящей работы явилось исследование обмена витамина D при сахарном диабете. Изучение этой проблемы по-

Рис. 1. Содержание глюкозы в сыворотке крови крыс после внутривенного введения аллоксана.

По оси ординат — уровень глюкозы (в ммоль/л); по оси абсцисс — время наблюдения (в сут).

Рис. 2. Транспорт |³Н]-холекальциферола через кишечник крыс в норме (/) и при аллоксановом диабете (2).

По осн ординат — суммарная радиоактивность (в имп/мии ^{— |}/мл ¹ • 10“³); по оси абсцисс — время (в ч).

зволит решить вопрос о необходимости назначения витамина D при данной патологии.

Материалы и методы

В опытах использовали 100 крыс линии Вистар с массой тела 120+5 г. Экспериментальный сахарный диабет вызывали путем внутривенного введения аллоксана из расчета 40 мг на 1 кг массы тела животного. Кровь брали из ретробульбарного синуса угла глаза под легким эфирным наркозом. Содержание глюкозы в сыворотке крови определяли с помощью тест-набора производства фирмы «Лахема» (ЧССР). Экстракцию витамина D и его активных метаболитов из сыворотки крови и печени крыс, их разделение и количественное распределение осуществляли согласно описанному ранее методу [1]. Гидролиз 0,5 г гомогената печени проводили 2 мл 30 % водного раствора КОН на кипящей водяной бане в течение 30 мин. Использовали [³Н] -холекальцифе- рол с удельной радиоактивностью 14 Ки/ммоль фирмы «Amersham» (Великобритания).

Результаты и их обсуждение

О развитии диабета у крыс судили по уровню глюкозы в сыворотке крови. Введение аллоксана в дозах, вызывающих диабет, приводит к двухфазной реакции изменения содержания сахара в крови. Она заключается в первоначальном, достигающем максимума через 48 ч, повышении уровня глюкозы, сменяющегося затем его снижением, которое продолжается до 10 сут (рис. 1). Однако и на 10-е сутки содержание глюкозы в сыворотке крови не достигает нормальных величин. В более поздние периоды времени возникает вторичная гипергликемия. На 20-е сутки в сыворотке крови отмечается максимальное повышение уровня глюкозы, не изменяющегося вплоть до 30-х суток. Возможно, что первичный подъем уровня сахара в крови связан с влиянием аллоксана на синтез инсулина и гормональную

Содержание 25(OH)D, 24,25(OH)2D и 1,25(OH)₂D в сыворотке крови крыс с аллоксановым диабетом (М+т, л=5)

Примечание. Достоверность различий по сравнению с нормой — одна звездочка р<0,01, две — р<0,001.

Рис. 3. Накопление [³Н]- холекальциферола в печени крыс в норме (/) и при аллоксановом диабете (2).

По оси ординат — содержание радиоактивности в ткани печени (в %); по оси абсцисс — время (в мин).

систему организма. Вторичная гипергликемия является следствием деструктивных изменений Р-клеток островков поджелудочной железы, снижением их числа до 20±5 против 58±7 у контрольных животных, что подтверждается гистохимическими исследованиями.

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о развитии диабета у крыс на 30-е сутки после введения аллоксана.

Определение обеспеченности организма активными метаболитами витамина D показало, что на 30-е сутки в сыворотке крови крыс с аллоксановым диабетом их содержание значительно уменьшается (см. таблицу). Причинами подобных изменений могут быть нарушения транспорта хо- лекальциферола через кишечник, а также процессов его гидроксилирования.

С целью выяснения процесса всасывания витамина D в кишечнике при диабете животным в пищевод вводили 9 пмоль [³Н] -холекальциферола. Через каждые 3 ч после введения метки определяли радиоактивность крови. Полученные результаты сравнивали с всасыванием [³Н] -витамина D у контрольных животных. Как видно на рис. 2, у животных контрольной группы содержание метки в сыворотке крови увеличивается, достигая максимума к 6 ч после ее введения. У крыс с аллоксановым диабетом во все временные интервалы значительно снижена суммарная радиоактивность крови. При этом максимум концентрации метки наблюдается позже и приходится на 12 ч. Уровень радиоактивности в точке максимума у контрольных животных более чем в 3 раза выше, чем у крыс с аллоксановым диабетом. Возможно, что отмеченные изменения транспорта витамина D через кишечник являются следствием структурных изменений мембран энтеро- цитов, вызванных нарушением липидного обме-

Рис. 4. Содержание [³Н]-холекальциферола (/) и [³Н] - 25(ОН)йз (2) в печени нормальных крыс (а) и при аллоксановом диабете (б).

По оси ординат — уровень радиоактивности (в имп/мин^-'/орган^-1 • 10^—3); по оси абсцисс—время (в мин).

Рис. 5. Содержание |³Н]-холекальциферола (/) и |³Н|- 25(OH)De (2) в сыворотке крови нормальных крыс (а) и при аллоксановом диабете (б).

По оси ординат—уровень радиоактивности (в имп/мин^-1 ■ 10^—3); по оси абсцисс — время (в мин).

на в организме при исследуемой патологии. Полученные результаты свидетельствуют, что у крыс с аллоксановым диабетом ингибируется транспорт холекальциферола через кишечник.

Установлено, что при диабете имеют место выраженные деструктивные изменения ткани печени и нарушения многих видов обмена в данном органе [3]. Поскольку превращение витамина D в его транспортную форму — 25(OH)D осуществляется в гепатоцитах, можно предположить, что в печени при исследуемой патологии нарушается обмен холекальциферола. С целью изучения этого процесса крысам контрольной и опытной групп внутривенно вводили 4,5 пмоль [³Н]-холекальциферола. Как видно на рис. 3 максимум радиоактивности в печени контрольных животных приходится на 45 мин после введения метки. Причем в этот временной интервал печенью поглощается около 70 % введенной в кровоток метки. Через 105 мин практически вся радиоактивность из печени удаляется. При аллоксановом диабете распределение общей радиоактивности в печени существенно изменяется. Несмотря на то что основной процент [³Н]-холекальциферола (до 50) включается в печень уже на 15-й минуте, а не на 45-й минуте, как это отмечено для контрольных животных, полностью метка не выводится даже на 240-й минуте. Через 105 мин после введения [³Н]-витамина D, когда в норме его обмен практически заканчивается, при диабете еще более 20 % общей радиоактивности остается в печени. Характер изменения содержания общей радиоактивности в печени крыс с аллоксановым диабетом свидетельствует, вероятно, о значительном снижении скорости обмена витамина D при данной патологии.

Различно протекает в печени и процесс гидроксилирования витамина D у нормальных крыс и у животных с экспериментальным сахарным диабетом. Как видно на рис. 4, максимум содержания [³Н] -холекальциферола в печени нормальных крыс приходится на 30-ю минуту после внутривенного введения метки. Содержание витамина D в это время в 2 раза выше,чем его гидроксилированной формы. Но уже на 45-й минуте на долю [³H]-25(OH)D приходится 62 % общей радиоактивности, содержащейся в это время в печени. Уровень неизмененного витамина D заметно уменьшается, и уже к 105-й минуте практически полностью происходит процесс гидроксилирования холекальциферола в печени контрольных крыс. В то же время в печени крыс с экспериментальным диабетом гидроксилируется не более 20 % холекальциферола. Причем на протяжении всего исследуемого временного интервала процесс превращения витамина D в 25(OH)D замедлен, и даже на 240-й минуте в печени животных остается более 20 % непревращенного витамина D. Замедленный процесс гидроксилирования витамина D в печени крыс при диабете может быть следствием либо уменьшения транспорта холекальциферола в гепатоциты, где происходит его гидроксилирование, либо ингибирования активности 25-гидроксилазы витамина D. Эти результаты подтверждаются данными о содержании витамина D и 25(OH)D в сыворотке крови (рис. 5). Если у животных контрольной группы на 15-й минуте около 90% общей метки сыворотки крови приходится на долю [³Н] -холекальциферола, то уже на 60-й минуте в сыворотке практически присутствует только [³Н] -25(ОН) D. В то же время у крыс с аллоксановым диабетом содержание витамина D находится практически на одном уровне. На 60-й минуте, когда у крыс контрольной группы в сыворотке крови обнаруживается только [³Н] -25 (ОН) D, у животных с диабетом до 50 % общей метки приходится на долю [³Н] -холекальциферола. Необходимо отметить также, что содержание [³H]-25(OH)D в этот период составляет только 40 % от его уровня у контрольных животных, что согласуется с более высоким уровнем витамина D в печени.

Выводы

1. При аллоксановом диабете нарушается процесс всасывания витамина D в кишечнике, в результате чего нарушается его поступление в организм.
2. Сахарный диабет сопровождается снижением интенсивности поглощения печенью из кровотока витамина D, увеличением периода его обмена в этом органе, нарушением процесса гидроксилирования витамина D в 25(OH)D.