Влияние биосинтетического инсулина на перекисное окисление липидов мембран эритроцитов у больных сахарным диабетом I типа

Имеющиеся многочисленные данные литературы указывают на участие свободнорадикальных реакций в патогенезе сахарного диабета (СД). Выявлены высокий уровень перекисей липидов в плазме крови [12], снижение продукции простациклина в артериях, нормализующиеся в ответ на введение а-токоферола [2], низкий уровень витамина Е и увеличение уровня тромбоксана в

тромбоцитах [4], повышенный уровень малонового диальдегида (МДА) — промежуточного продукта перекисного окисления липидов (ПОЛ) в эритроцитах у больных СД и у крыс со стрепто- зотоцининдуцированным диабетом [6, 8,                                                                                                   13].

Свободнорадикальные реакции могут вносить вклад в развитие осложнений СД. Описано увеличение адгезии эритроцитов к эндотелиальным клеткам при СД. Усиление адгезии эритроцитов, коррелирующее с накоплением продуктов ПОЛ в клетке, и избирательное ингибирование синтеза простациклина в артериях могут, по крайней мере частично, быть ответственными за сосудистые осложнения СД. Концентрация эндогенных перекисей липидов в тканях определяется соотношением скоростей их образования и распада. Утилизация гидроперекисей липидов осуществляется компонентом системы антиоксидантной защиты (АОЗ) клетки. Данные о состоянии АОЗ эритроцитов у больных СД крайне противоречивы [5, 9, 10, 13]. Это может быть объяснено тем, что для исследования брали кровь больных СД разного возраста, с разной продолжительностью заболевания, при этом не учитывали наличие сосудистых осложнений. Свободнорадикальное окисление биомакромолекул рассматривается как один из факторов старения, с возрастом отмечаются накопление продуктов ПОД в крови и изменение состояния АОЗ клеток [2, 3], поэтому не исключено, что результаты исследований, проведенных у пожилых больных СД, будут отличаться от данных, полученных при обследовании детей и лиц молодого возраста.

Целью настоящей работы явилось исследование ПОЛ мембраны эритроцитов и состояния ферментов АОЗ эритроцитов в зависимости от возраста больных СД I типа, продолжительности заболевания и наличия сосудистых осложнений. Кроме того, исследовали возможность коррекции перекисного статуса эритроцитов с помощью терапии инсулином человека.

Материалы и методы

Обследовано 16 больных (4 женщины, 12 мужчин) в возрасте 20—43 лет (10 — до 35 лет, 6 — старше 35 лет) и 15 здоровых доноров в возрасте 25—46 лет. К моменту обследования 15 больных находились в состоянии субкомпенсации (средний уровень гликемии натощак 9,56±0,27 ммоль/л, гликозилированный гемоглобин — НЬА|_С — 9,21±0,32 %), 1 больной — в состоянии компенсации (гликемия натощак 4,4 ммоль/л, НЬА|_С 6,5%). У 8 пациентов длительность СД составляла более 10 лет, у 8 — до 10 лет. Диабетические сосудистые осложнения (диабетическая нефропатия, диабетическая ретинопатия, микро-, макроангиопатии нижних конечностей) наблюдались у 9 больных (у 1 больной с длительностью диабета 9 лет, у 8 — более 10 лет). Больные находились на режиме двукратного введения Humulin S, Humulin 1 или Humulin М3 (инсулины фирмы «Lilly», Франция).

Кровь для исследования брали из локтевой вены (в 3,8 % растворе цитрата Na в соотношении 9:1) натощак до начала лечения препаратами инсулина человека, а также через 2, 6, 12 нед терапии. Эритроциты осаждали на центрифуге фирмы «Beckman» (1500 g, 15 мин, при 4 °C) с последующим троекратным промыванием охлажденным физиологическим раствором (150 мМ NaCl, 5 мМ Na-фосфатный буфер, pH 7,4) и замораживанием при —20 °C до начала исследования. Уровень МДА в эритроцитах определяли флюориметрическим методом, активность супероксиддисмутазы (СОД) измеряли в осветленном от гемоглобина гемолизате эритроцитов, используя ферментзависимое ингибирование адреналин-адре- нохромового превращения, активность каталазы определяли при 240 нм по скорости изменения поглощения Н₂О₂ в единицу времени, активность глутатионпероксидазы (ГП) измеряли при 340 нм, используя Н₂О₂ в качестве субстрата реакции [1]. Гемоглобин определяли гемоглобин-цианидным методом, белок — методом Лоури, уровень глюкозы крови — глюкозооксидантным методом, НЬА|_С — методом колоночной хроматографии с помощью набора Bio-Rad (ФРГ). Статистическую обработку результатов проводили, применяя /-критерий Стью- дента. Достоверными считали различия при р<0,05.

Уровень МДА (в нмоль на 1 мг белка) мембраны эритроцитов у больных инсулинзависимым диабетом на фоне лечения биосинтетическими инсулинами.

К — контроль; AI — больные с ангиопатиями; АП — больные без ангиопатий; В/— больные до 35 лет (средний возраст 25,5±1,3 года); BII — больные старше 35 лет (средний возраст 40,2±1,1 года); CI — больные с длительностью заболевания до 10 лет (средняя продолжительность 6,4±1,0 года); СП — больные с длительностью заболевания более 10 лет (средняя продолжительность 15,9±1.1 года); а — до начала лечения; б — через 12 нед лечения; крестик — р<0,05; три крестика—р<0,001 по сравнению с контролем; кружок— р<0,05 по сравнению с больными до начала лечения; звездочка — р<0,05 между больными с ангиопатиями и без ангиопатий через 12 нед терапии.

Результаты и их обсуждение

Уровень МДА у всех обследуемых больных достоверно не различался до начала лечения и превышал более чем в 2 раза показатели у здоровых доноров. В процессе лечения препаратами инсулина человека наблюдалась полная нормализация ПОЛ у больных без сосудистых осложнений, у больных в возрасте до 35 лет и у пациентов с продолжительностью заболевания менее 10 лет. У больных СД с ангиопатиями содержание МДА через 12 нед лечения биосинтетическими инсулинами превышало контрольное значение на 47 % (р<0,05), у больных старше 35 лет — на 58 % (р<0,05) и у больных с продолжительностью заболевания более 10 лет — на 43 % (р<0,05; см. рисунок).

У всех больных активность ферментов до начала лечения препаратами инсулина человека не различалась. Через 12 нед терапии активность каталазы у больных с ангиопатиями увеличивалась на 53 % (р<0,05), у больных старше 35 лет — на 53 % (р<0,05) и у пациентов с продолжительностью заболевания более 10 лет — на 51 % (р<0,05). В остальных группах больных активность каталазы не отличалась от этого показателя до начала лечения. Активность ГП снижалась в процессе лечения у всех больных. Минимальное значение активности ГП отмечалось у больных старше 35 лет (22 % от уровня до лечения и 30 % от уровня контроля) и у больных с продолжительностью заболевания более 10 лет (24 % от уровня до лечения и 31 % от уровня контроля). Активность СОД снижалась в процессе лечения инсулином у всех больных приблизительно на 30— 40%.

Установлено, что у всех больных СД ПОЛ мембраны эритроцитов активируется, а степень активации не зависит ни от продолжительности заболевания, ни от наличия сосудистых осложнений, ни от возраста пациента, хотя наблюдалась тенденция к увеличению уровня МДА у более пожилых больных. Через 12 нед лечения препаратами инсулина человека по мере достижения компенсации углеводного обмена отмечалась нормализация процессов ПОЛ мембраны эритроцитов у больных без сосудистых осложнений, у пациентов более молодого возраста и с длительностью заболевания менее 10 лет. В случаях, когда течение болезни осложнялось ангиопатиями или возраст пациентов превышал 35 лет, или заболевание длилось более 10 лет, нормализация уровня глюкозы крови не сопровождалась восстановлением параметров ПОЛ. Можно предположить, что в последних трех группах, помимо гипергликемии, которую рассматривают в качестве причины активации ПОЛ при диабете [6—7], в плазме крови или в эритроците присутствуют прооксидантные факторы. У больных с ангиопатиями источником дополнительных прооксидант- ных влияний может быть повышенное содержание липопротеидов, окисленных продуктов холестерина, модифицированных молекул липопротеидов низкой плотности и более высокий уровень ненасыщенных жирных кислот, что характерно для течения СД с сосудистыми осложнениями [2]. У пожилых пациентов с возрастом накапливаются продукты ПОЛ и нормогликемия на фоне приема препаратов инсулина не сопровождается устранением прооксидантных воздействий. У больных с продолжительностью заболевания более 10 лет повышенное содержание ПОЛ мембраны эритроцитов предотвращается введением инсулина. В эксперименте на крысах с стрептозотоцининду- цированным диабетом показано, что выраженность ПОЛ не зависит от длительности гипергликемии [8], что полностью совпадает с нашими наблюдениями.

Помимо возможного усиления прооксидантных воздействий в группах больных с ангиопатиями, пожилого возраста и с большей длительностью заболевания можно предположить снижение мощности АОЗ эритроцитов у этих пациентов. По результатам настоящего исследования мощность ферментативного звена АОЗ эритроцитов у всех больных СД была приблизительно одинаковой и не отличалась от нормы. Применение биосинтетических инсулинов человека в течение 12 нед вызывало повышение активности каталазы у больных с ангиопатиями, больных старше 35 лет и у пациентов с большей длительностью заболевания. Снижение активности ГП и СОД наблюдалось во всех группах больных и не зависело ни от возраста пациента, ни от длительности заболевания, ни от наличия сосудистых осложнений. Есть данные, что инсулинчувствительная НАДФ-дегидрогеназа генерирует большое количество Н2О2, которую рассматривают в качестве трансдуктора гормонального сигнала [11]. Накопление НгО₂ в эритроцитах больных СД под действием инсулина может вызывать компенсаторное увеличение активности каталазы, с одной стороны, и усиление ПОЛ — с другой. Так как каталаза разрушает перекись водорода, но не разрушает гидроперекиси липидов (эту функцию выполняет ГП, активность которой значительно понижена), активация каталазы не приводит к усилению АОЗ эритроцитов в целом. Если допустить, что увеличение активности каталазы у больных с ангиопатиями, пожилого возраста и с давностью заболевания более 10 лет вызвано большими концентрациями Н₂Ог в эритроцитах этих пациентов, то этот факт может, хотя бы частично, объяснить неэффективность инсулина в отношении нормализации ПОЛ мембраны эритроцитов. Но почему инсулин вызывает большие накопления Н2О2 в эритроцитах именно этих групп больных? Для ответа на этот вопрос следует провести дополнительные исследования.

Выводы

1. До начала лечения препаратами инсулина человека уровень МДА мембран эритроцитов у больных СД всех исследуемых групп достоверно не различался и был более чем в 2 раза выше, чем у здоровых.
2. Через 12 нед инсулинотерапии у больных СД без сосудистых осложнений, в возрасте моложе 35 лет и у пациентов с продолжительностью заболевания менее 10 лет наблюдалась полная нормализация ПОЛ мембраны эритроцитов.
3. У больных СД с ангиопатиями, старше 35 лет и с продолжительностью заболевания более 10 лет уровень МДА эритроцитов через 12 нед терапии биосинтетическими инсулинами человека снижался, но оставался выше, чем у здоровых доноров, приблизительно в 1,5 раза.
4. Активность ферментов АОЗ эритроцитов не различалась во всех исследуемых группах больных СД и не отличалась от контроля.

• Через 12 нед получения препаратов инсулина человека активность каталазы эритроцитов увеличилась приблизительно на 50 % у больных с ангиопатиями, старше 35 лет и с продолжительностью заболевания более 10 лет. В остальных группах больных активность каталазы не отличалась от исходного значения.

Активность ГП и СОД эритроцитов в процессе лечения инсулинами снижалась во всех исследуемых группах больных СД.