Характеристика рецепторов b-клеток поджелудочной железы, связывающих сульфаниламидные препараты, при экспериментальном сахарном диабете

Идентификация высокоспецифических рецепторов для сульфаниламидных препаратов на мембране р-клеток [4, 14] наряду с наличием АТФ-за- висимых К+-каналов, а также других каналов, в том числе и Са2+-чувствительных [12, 13], позволила исследователям расшифровать молекулярные основы механизма действия сульфаниламидных препаратов различной генерации, обладающих сильными гипогликемическими свойствами. В основе этих механизмов лежат высокая степень сродства и прочное лигандно-рецепторное взаимодействие этих препаратов с пептидными образованиями, расположенными на мембране р-клеток и дающими возможность стимулировать выделение инсулина.
Приведенные выше данные относятся к характеристике функционально-интактных р-клеток, в то время как клиницисты применяют сульфаниламидные препараты для лечения больных диабетом II типа, т. е. инсулиннезависимого, с частично пораженными р-клетками. Приоритетность данной работы состоит в том, что проведена оценка рецепторных свойств р-клеток, функционально ослабленных под влиянием различных доз стрептозотоцина. Аналогичных работ встретить в литературе нам не удалось.
Материалы и методы
Работа проведена на культивируемых р-клетках поджелудочной железы. Выделение и культивирование р-клеток осуществляли по методу [11]. Островки р-клеток, полученных по- j еле переваривания коллагеназой мелко изрезанной поджелудочной железы крыс-самцов линии Спрей Даули, высевали небольшими группами и инкубировали с ферментом dispase [10]. Клетки, полученные таким путем, увеличивали свою секреторную активность в 3 раза в среде, содержащей К) мМ глюкозы. В дальнейшем эти клетки помешали в чашки Петри и культивировали в среде, содержащей 10% инактивированной сыворотки телят, 0,5% пенициллина и 0,5% стрептомицина в смеси 5% COj/95% воздуха в течение 1—10 дней при 37“С. Культивируемые клетки переносили механическим путем в среду, содержащую 140 мМ N-метилгликамида, 10 мМ КС1 с добавлением 20 мМ буфера HEPES/NaOH (pH 7,5), при 37°С. Суспензию диссоциированных клеток использовали для определения связывания, применяя 140 мМ N-метилгликамида, 1,8 мМ Са2+, 0,8 мМ MgCl, 2,1 мМ КС1 в 20 мМ HEPES-трис- буфере при pH 7,5 и 4"С.
В работе использовали 3Н-глибенкламид со специфической радиоактивностью 26,4 Ки/ммоль. Для определения связывания суспензию [3-клеток инкубировали при 4°С в растворе, содержащем 3Н-глибенкламид. Инкубация длилась 60 мин, после чего раствор фильтровали через фильтр ватмановской бумаги jF/B с помощью вакуумного насоса. Фильтр промыва- ли 100 мМ трис-НС1-буфером при pH 7,5 и 4°С. Неспеци- * фическое связывание определяли с помощью 1 мкМ немеченого глибенкламида.
Связывание 3 Н-глибенкламида с микросомами
Микросомальную фракцию получали из инкубированных р-клеток, промытых однократно на льду буфером, содержащим 0,3 М сахарозы, 40 мМ HEPES/NaOH, которые затем были 5-кратно гомогенизированы. Суспензию из этих клеток осаждали в течение 10 с и центрифугировали при 70 000 g в течение 25 мин. Готовую для работы микросомальную фракцию получали после осаждения буфером, содержащим 20 мМ HEPES/NaOH, при pH 7,5. Дальнейшая методика определения связывания микросомальной фракции с 3Н-глибенклами- дом была аналогична таковой для р-клеток. Связывание 3Н- глибенкламида было пропорционально концентрации белка мембраны в пределах 0,2—1,2 мг/мл. Опыты повторяли дважды.
Частичное поражение р-клеток в экспериментах достигалось добавлением в культивируемую среду стрептозотоцина в различных концентрациях (1, 2 и 5 ммоль), растворенного в цитратном буфере. Этот препарат добавляли в чашку Петри с помощью локальной перфузии. Время воздействия составляло 30 мин, после чего проводили отмывание и дальнейшую инкубацию. В инкубате до и после воздействия стрептозотоцина определяли концентрацию инсулина, что и было показателем степени поражения р-клеток.
Результаты и их обсуждение
Предварительно проведенные нами исследования на интактных р-клетках поджелудочной железы показали высокую способность специфического связывания 3Н-глибенкламида как с суспензией р-клеток, так и с мембранными микросомальными фракциями р-клеток, а также блокаду этого связывания рядом гипогликемических препаратов сульфаниламидного ряда [2]. Неспецифическое связывание составляло лишь 8% от общего связывания. В настоящем исследовании оригинальным является тот факт, что условия проведения эксперимента на функционально ослабленных р-клетках моделируют диабет II типа, для лечения которого в клинике весьма широко используются сульфаниламидные препараты.

Рис. 1. Связывание 3Н-глибенкламида с микросомальной фракцией р-клеток, функционально ослабленных под действием стрептозотоцина.
а — связывание 3Н-глибенкламида, По оси абсцисс — концентрация свободного 3Н-глибенкламида (в нМ); по оси ординат — концентрация связанного 3Н- глибенкламида (в фмоль на 1 мг белка). 1 — общее связывание (в отсутствие немеченого глибенкламида); 2 — нсспецифическое связывание (в присутствии немеченого глибенкламида); 5 — специфическое связывание; б — график Скетчарда для специфического связывания 3Н-глибенкламида. По оси абсцисс — концентрация связанного 3Н-глибенкламида (в фмоль на 1 мг белка); по оси ординат — отношение специфически связанного 3Н-глибенкламида к свободному.

Рис. 2. Ингибирование гипогликемическими препаратами связывания 3Н-глибенкламида с микросомальной фракцией Р-клеток (о) и суспензией р-клеток (б), функционально ослабленных под влиянием стрептозотоцина.
По оси абсцисс — Jog концентрации препарата; по оси ординат — специфическое связывание 3Н-гллбенкламида (в % от максимума). 1 — глибенкламид; 2 — глипиэид; 3 — гликлазид.
На рис. 1 и 2 представлены кривые, демонстрирующие связывание 3Н-глибенкламида с суспензией р-клеток и с мембранами микросомальных фракций ослабленных р-клеток, а также блокаду этого связывания некоторыми гипогликемическими препаратами сульфаниламидного ряда. Скетчардовские кривые специфического связывания представляют собой вариант высокого сродства мест связывания с константой диссоциации (Кд = 0,3 нМ), а максимальная связывающая способность, хотя и была достаточно высока (llO- llS фмоль/мг белка при 4°С), оказалась значительно ниже, чем у интактных клеток. Специфическое связывание 3Н-глибенкламида с микросомальной фракцией р-клеток блокировалось значительно меньшими концентрациями немеченого глибенкламида, а также некоторыми другими сульфаниламидными препаратами (глипизид и гликлазид), чем это наблюдалось на интактных клетках. Применение в качестве контроля других препаратов, дающих гипогликемический эффект, но не относящихся к сульфаниламидам, показало их неспособность влиять на связывание 3Н-гли- бенкламида с микросомами р-клеток.
В работе на суспендированных клетках при анализе степени ингибирования 3Н-глибенклами- да использованными нами препаратами получены аналогичные результаты. Эти вещества по степени активности располагались следующим образом: глибенкламид — глипизид — гликлазид.
Следует обратить внимание на то, что связывание меченого глибенкламида пораженными клетками было обратимо, и, что очень важно, рецепторные места были локализованы на стороне плазменной мембраны и число их составляло 5,12 ± 0,5 на клетку.
Анализ полученных нами данных свидетельствует о том, что связывающие свойства р-клеток, функционально ослабленных под влиянием стрептозотоцина, при применении сульфаниламидных препаратов не изменяются. Возможно, что в наших экспериментальных условиях имеет место скорее снижение числа р-клеток, нежели такие специфические их свойства, как связывание с сульфаниламидными препаратами. Это требует доказательства другими методами, хотя в предыдущих наших исследованиях, касающихся электрофизиологических оценок ионных каналов функционально-ослабленных р-клеток, имело место изменение их свойств под влиянием стрептозотоцина [1, 3]. В связи с этим представляет интерес обсудить вопрос о том, не являются ли сульфаниламидные рецепторы на р-клетках К+-АТФ- чувствительными каналами. Это предположение было впервые выдвинуто N. Sturgess и М. Ashford в 1985 г. [15]. Сопоставление данных о связывании сульфаниламидных препаратов с рецепторами р-клеток и показателями ингибирования К+- АТФ-чувствительных каналов, полученных с помощью различных методических приемов, с данными о механизме запуска секреции цнеулина предполагает, что сульфаниламидные рецепторы являются К+-АТФ-чувствительными каналами. Следует, однако, отметить, что секретогены из ряда сульфаниламидных препаратов, а также метаболиты глюкозы, блокируя К+-АТФ-чувствитель- ные каналы, проявляют свое действие через различные локусы клетки. Если сульфаниламидные препараты действуют на внутреннюю сторону плазменной мембраны, то АТФ — на цитоплазматическую поверхность мембраны [4]. Концепция рецептора как ионного канала не нова, так как показано, что Ка+-канал в мышцах является никотин-ацетилхолиновым рецептором, а дигидропиридиновый рецептор — Са2+ -каналом [4]. В обоих случаях специфические лиганды связываются с экстраклеточной частью канала [4, 9]. Специалисты обращают также внимание на тот факт, что в механизме возникновения внутриклеточного сигнала значительная роль отводится АТФ и АДФ [5, 16]. По-видимому, они выполняют двоякую роль — регулируют работу ионных каналов и являются донорами фосфата в реакциях фосфорилирования [6, 17, 18]. Оба нуклеотида присутствуют в р-клетках в незначительных количествах: концентрация АТФ в р-клетках составляет 3— 5 мМ, необходимая же концентрация для блокады К+-каналов намного выше. АДФ меняет чувствительность каналов к АТФ. В связи с этим становится ясным факт снижения эффективности действия АТФ в проявлении ингибиторных свойств сульфаниламидных препаратов при блокаде К+- каналов. Глюкоза очень быстро меняет отношение АТФ/АДФ в р-клетках в сторону его увеличения. Допускается мысль о том, что энергетическое состояние р-клеток является главным фактором в механизме секреции инсулина, а также то, что сульфаниламидные препараты оказывают действие на те же места в клетке, что и глюкоза [7, 8].
Собственные наблюдения и данные литературы позволяют утверждать, что увеличение выделения инсулина под влиянием сульфаниламидов обеспечивается за счет связывания их с высокоспецифическими рецепторами на мембране плазмы клеток. Состояние рецепторного аппарата, обеспечивающего взаимодействие сульфаниламидных препаратов и мембран р-клеток, функционально ослабленных под влиянием стрептозотоцина, существенно не отличается от рецепторного аппарата интактных р-клеток. Тесное взаимодействие рецепторов и сульфаниламидных пре-
паратов, предотвращая выход К+ и блокируя тем самым К+-АТФ-чувствительные каналы, запускает выделение инсулина. Отсутствие принципиальных изменений в показателях, характеризующих связывающие свойства сульфаниламидных препаратов с мембранами пораженных р-клеток с одно- * временным изменением электрофизиологических параметров К+-АТФ-чувствительных каналов, позволяет высказать предположение об отсутствии идентичности между сульфаниламидными рецепторами р-клеток и ионными каналами.
Выводы
1. Выявлены и охарактеризованы рецепторы сульфаниламидных препаратов (глибенкламида, глипизида, гликлазида) на р-клетках, функционально ослабленных под влиянием стрептозотоцина.
2. Связывающие свойства микросомальной фракции р-клеток и суспензии р-клеток, подвергнутых воздействию стрептозотоцина, существенно не отличаются от таковых интактных р-клеток.