Иммуноанализ свободной а-субъединицы гликопротеиновых гормонов в сыворотке крови человека и ее взаимоотношения с гликопротеиновыми гормонами гипофиза

Гормоны гипофиза — тиреотропный (ТТГ), лютеинизирующий (ЛГ) и фолликулостимулирующий (ФСГ) — являются гликопротеинами, построенными из двух различных субъединиц [2]. Они содержат в своем составе идентичную для всей группы а-субъединицу (АС) и специфичную для каждого гормона р-субъединицу. а-, (3- Субъединицы кодируются различными генами, локализованными на разных хромосомах [2, 5]. Их биосинтез происходит раздельно. Зрелые биологически активные молекулы ТТГ, ЛГ и ФСГ, секретируемые в кровь, образуются в клетках гипофиза в результате нековалентной ассоциации АС с соответствующими р-субъ- единицами. Показано, что АС в виде свободной молекулы может секретироваться в кровь в очень небольшом количестве в нормальных условиях и в повышенном количестве при некоторых нарушениях функции клеток гипофиза [3]. Поэтому исследование самостоятельной секреции АС представляет определенный научный интерес и диагностическую ценность.

В связи с этим нами была разработана на основе АС, полученной путем диссоциации молекулы ТТГ человека, специальная радиоиммуногическая тсст- система, позволяющая избирательно измерять уровень свободной АС в сыворотке крови человека.

В настоящей работе приведена характеристика ключевых реагентов, использованных для конструирования тест-системы, ее аналитических параметров, специфичности по отношению к гликопротеиновым гормонам, в состав которых она входит. Кроме того, с помощью разработанной тест-системы изучены взаимоотношения свободной АС и гликопротеиновых гормонов при различном уровне их секреции у больных с эндокринными нарушениями, содержание свободной АС в сыворотке крови у практически здоровых женщин и у женщин с клинически нефункционирующими опухолями гипофиза, когда секреция АС, по некоторым данным [3, 5], может повышаться.

Материалы и методы

Все основные компоненты тест-системы — препарат АС, специфическая антисыворотка против нее, АС, меченная ^ш1, а также высокоочпщенпые ТТГ, ЛГ и ФСГ человека для исследования перекрестных реакций были получены в лаборатории.

ТТГ выделяли из постмортальных человеческих гипофизов методом |6], в котором в качестве ключевых этапов очистки использовали ионообменную хроматографию на КМ- и ДЭАЭ-целлюлозах и гель-фильтрацию на сефадсксах. Иммунологическая активность препарата ТТГ на конечной стадии очистки в ра- диоиммунологической системе достигала 11 ME на 1 мг белка. Этот препарат являлся исходным для получения АС методом [4] с использованием 8 М мочевины и противоточного распределения в двухфазной системе, содержащей сульфат аммония, 0,2% дихлоруксусную кислоту, н-пропанол, этанол в соотношении 60:60:27:33. АС, находившуюся в нижней фазе, после удаления органических растворителей на роторном испарителе и солей посредством диализа освобождали от остатков недиссоциировавшего ТТГ гель-фильтрацией на колонке с сефадексом G-100.

Антисыворотку против АС получали иммунизацией кроликов путем множественных (20-30) внутрикожных и подкожных инъекций раствора АС. Первую иммунизацию проводили 130 мкг АС в полном адъюванте Фрейнда, повторную — через 1 мес 100 мкг АС также в полном адъюванте и две поддерживающие — по 20 мкг АС с интервалом I мес. Контроль за образованием антител и ростом их титра осуществляли в иммуноферментной системе и по реакции иммунопреципитации в агаре.

Йодирование АС осуществляли ^1И1 с помощью йодогена. Отделение несвязанного йода проводили гель-фильтрацией реакционной смеси через колонку с сефадексом G-75. Техника определения АС соответствовала традиционной схеме радиоимму- пологического анализа. Исследуемый образец сыворотки крови или стандарта АС инкубировали с моноспецифическими антителами к АС, выработанными у кролика, при комнатной температуре в течение 2 ч. Затем в реакционную смесь добавляли меченую АС и после перемешивания инкубировали в течение 18 ч при комнатной температуре, после чего добавляли вторые антитела к иммуноглобулинам кролика, с помощью которых в присутствии полиэтиленгликоля иммунный комплекс АС с антителами к ней выпадал в осадок. После инкубации со вторыми антителами в течение 1 ч при комнатной температуре осадок собирали центрифугированием, отсасывали надосадочную жидкость с помощью водоструйного насоса и измеряли радиоактивность осадка на гамма-счетчике.

Содержание ТТГ, ЛГ и ФСГ в сыворотках крови определяли радиоиммунологичсским методом с помощью тест-систем, разработанных в лаборатории на основе соответствующих высоко- очищенных антигенов и моноспецифических антисывороток. В качестве рабочих стандартов при этом использовали высокоочищенные препараты гормонов, аттестованные по соответствующим международным стандартам, полученным из Национального института биологических стандартов и контроля (Лондон). Содержание гормонов, также как и АС, выражали в нанограммах на 1 мл сыворотки крови.

Результаты и их обсуждение

На рис. I можно видеть результат разделения ТТГ человека на субъединицы с помощью противоточного распределения в двухфазной системе. График отражает оптическую плотность в верхней и нижней фазах после 10 последовательных переносов фаз. Верхняя фаза содержала р-субъсдиницу. АС вместе с оставшейся недиссоциировавшей небольшой частью гормона находилась в нижней фазе. После освобождения от примеси голо-ТТГ путем гельфильтрации полученная таким образом АС давала в радиоиммунологичсской тест-системе для ТТГ человека перекрестную реакцию менее 0,2%. Этот прс-

Рис. 1. Разделение ТТГ человека на субъединицы методом противоточного распределения в двухфазной системе. Условия см. в разделе “Материалы и методы”.

По оси ординат — оптическая плотность при длине волны 280 нм; по оси абсцисс — номера пробирок.

парат АС использовали в качестве антигена для выработки специфических антител, для получения АС, меченной ^|251, и в качестве стандарта для калибровочной кривой.

На основе высокоочищенного препарата АС, кроличьей антисыворотки против АС и радиоактивно меченного лиганда была сконструирована радиоим- мунологическая тест-система для определения АС в сыворотке крови человека. Титр антител к АС, использованный в тест-системе, составлял 1:50 000. Типичная калибровочная кривая тест-системы для количественного определения АС представлена на рис. 2. Она включает 7 разведений препарата АС — от 0,4 до 50 нг/мл. Чувствительность тест-системы 0,15 нг/мл. Коэффициент вариаций результатов определения не превышал 7%.

При создании иммунохимической тест-системы для количественного анализа АС необходимо было учитывать, что АС является одинаковой для всей группы гликопротеиновых гормонов гипофиза — ТТГ, ЛГ и ФСГ и потому при использовании кроличьей антисыворотки против АС, полученной из молекулы ТТГ, возможно некоторое ее перекрестное взаимодействие со всеми этими гормонами.

Рис. 2. Калибровочная кривая тсст-систсмы для определения свободной АС гликопротеиновых гормонов гипофиза.

По осн ординат — В/В_о-100 1в %); ио оси абсцисс — концентрация свободной АС » стандартных пробах (в нг/мл; логарифмическая шкала).

Рис. 3. Исследование перекрестных реакций ТТГ, ФСГ и ЛГ в тест-системе для определения АС человека.

По оси ординат — В/В_а-100 (в %); по оси абсцисс — концентрация свободной АС или ТТГ, ЛГ, ФСГ (в нг/мл).

Исследование специфичности антисыворотки против свободной АС, использованной в разработанной тест-системе, а также возможных перекрестных реакций гликопротеиновых гормонов в этой системе было осуществлено с помощью высокоочищеи- ных препаратов ТТГ, ЛГ и ФСГ человека, полученных в лаборатории и аттестованных по соответствующим международным стандартам ВОЗ. Интервалы концентраций, в пределах которых были исследованы перекрестные взаимодействия, составляли для ТТГ 3-400 нг/мл, для ЛГ 0,3—390 нг/мл, для ФСГ 3,7-480 нг/мл. Максимальные величины этих концентраций превышали наибольшую дозу калибровочной кривой в радиоиммунологической системе для определения свободной АС в 8-9 раз. Результаты исследования перекрестных реакций при использовании тех же доз, что и для АС, представлены на рис. 3. В пересчете на массу препаратов гликопротеиновых гормонов перекрестная реакция в разработанной тест-системе для определения свободной АС составляла в случае ТТГ 3,7%, ФСГ 10%, ЛГ 16 %.

С целью изучения взаимоотношений между определяемыми радиоиммунологическим методом гликопротеиновыми гормонами и свободной АС в крови нами был проведен одновременный их количественный анализ в сыворотках крови случайной выборки больных —   14 женщин с разным

эндокринным статусом и различным уровнем гликопротеиновых гормонов, особенно ФСГ и ЛГ. Анализ полученных при этом данных (рис. 4) свидетельствует об отсутствии обязательной корреляции между уровнями свободной АС и гликопротеиновых гормонов в крови. У некоторых пациенток при резко повышенном содержании ФСГ определяемый уровень свободной АС был невысоким (например, сыворотки 3, 5, 6 на рис. 4). Вместе с тем у других больных, имевших достаточно высокое содержание АС в сыворотке крови (сыворотки 7-14), величины содержания гликопротеиновых гормонов были более низкими и не могли с учетом выявленной перекрестной иммуиореактивности объяснить столь вы-

Рис. 4. Содержание (в нг/мл - по оси ординат) АС (темные столбики), ЛГ (столбики с косой штриховкой), ФСГ (столбики с горизонтальной штриховкой) и ТТГ (светлые столбики) в сыворотках крови 14 женщин с различным эндокринным статусом (по оси абс

цисс).

сокий уровень иммунореактивности АС в этих сыворотках.

Таким образом, полученные данные указывают, с одной стороны, на специфичность разработанной нами тест-системы для свободной АС, а с другой — подтверждают возможность независимой секреции гипофизом свободной АС в кровь.

Необходимо отметить, что в сыворотках крови 5 женщин с крайне высоким уровнем гонадотропинов в сыворотке крови (более 30 ЕД/л) вследствие развития посткастрационного синдрома после гона- дэктомии нами с помощью разработанной тест-системы были обнаружены высокие величины содержания иммунореактивной АС (2,94-13,6 нг/мл). Однако в таких случаях сочетания высокого уровня гонадотропинов и АС судить об истинном содержании последней в сыворотке крови, учитывая существование определенной перекрестной иммунореактивности между этими близкими антигенами, можно было бы только после предварительного разделения фракций свободной АС и гонадотропинов, например путем гель-фильтрации сыворотки крови.

Поскольку в литературе имеются сведения о возможности повышения секреции свободной АС в кровь при гормонально-неактивных, клинически не функционирующих опухолях гипофиза [3], мы изучали содержание свободной АС в сыворотке крови 24 женщин в возрасте 18-36 лет (находившихся на обследовании в Институте клинической эндокринологии ЭНЦ РАМН) с диагнозом нефункционирующей опухоли гипофиза. Наличие опухоли гипофиза было диагностировано на основании данных компьютерной или магнитно-резонансной томографии области турецкого седла.

Для контроля содержание свободной АС определяли также у 12 женщин 17-30 лет без признаков эндокринных заболеваний. У этой группы женщин базальный уровень АС в сыворотке крови был довольно низким и составлял в среднем 0,9+0,22 нг/ мл (М±а ), что практически не отличалось от “нормального” содержания АС в сыворотке крови женщин до наступления менопаузы, установленного аналогичным радиоиммунологическим методом другими авторами [1, 3]. Однако у 15 из 24 пациенток с нефункционирующей опухолью гипофиза он превышал среднее содержание в контрольной группе более чем на величину 2а, а у некоторых больных — в 2-2,5 раза. При этом уровень гликопротеиновых гормонов гипофиза в сыворотке крови был в пределах нормы. На рис. 5 можно видеть, что воз-

Рис. 5. Возможный суммарный вклад ТТГ, ЛГ и ФСГ (заштрихованная часть столбиков) в определяемый уровень АС в сыворотке крови за счет перекрестных реакций.

По оси ординат — содержание АС (в нг/мл); по оси абсцисс — сыворотки крови 7 больных с нефункционирующими аденомами гипофиза. можный суммарный вклад гликопротеиновых гормонов в определяемый уровень свободной АС в сыворотке крови 7 женщин с нефункционирующими опухолями гипофиза был крайне незначителен.

Таким образом, можно заключить, что наличие у этих больных в сыворотке крови иммунореактивной АС является истинным и не зависит от секреции гипофизом гликопротеиновых гормонов.

Выводы

1. Сконструирована радиоиммунологическая тест- система для количественного определения свободной АС гликопротеиновых гормонов в сыворотке крови человека с чувствительностью 0,15 нг/мл.
2. С помощью разработанной тест-системы установлено отсутствие прямой корреляции между уровнем свободной АС и содержанием гликопротеиновых гормонов в сыворотке крови у обследованных женщин с различным эндокринным статусом, что свидетельствует, с одной стороны, о специфичности тест-системы, а с другой — подтверждает возможность независимой секреции гипофизом свободной АС в кровь.
3. Базальное содержание свободной АС в сыворотке крови практически здоровых людей находится на низком уровне: у женщин в возрасте 17-30 лет оно составляет в среднем 0,9 нг/мл.

Выявлено повышение уровня секреции свободной АС в крови у значительной части больных с нефункционирующими опухолями гипофиза, что указывает на диагностическое значение определения свободной АС в качестве маркера этих опухолей.