Характеристика рецепторов бета-клеток поджелудочной железы, связывающих сульфаниламидные препараты

Сульфаниламидные препараты, являясь сильными гипогликемическими веществами, широко используются в лечении диабета II типа. Подобно глюкозе сульфаниламиды вызывают изменения электрической активности в [-клетках островков поджелудочной железы, конвенгируя главным образом на уровне АТФ-зависимых К⁺-каналов, не исключается их действие и на различные другие типы Са²⁺- чувствительных каналов.

Вместе с тем в последнее время па мембране [клеток обнаружены и идентифицированы высокоспецифические рецепторы для сульфаниламидных препаратов. Большие возможности сульфаниламидных препаратов второй генерации связываются с их возможностью запускать выделение инсулина в на- номолярных концентрациях за счет высокой степени их сродства и прочного лигандно-рецепторного взаимодействия с рецепторными образованиями.

Имеющиеся в литературе данные по оценке связывающих способностей сульфаниламидных препаратов с [-клетками весьма ограничены [2, 12]. В связи с этим нами была проведена работа по анализу рецепторного связывания глибенкламида, глик- лазида и глипизида с [-клетками.

Материалы и методы

Работа проводилась на культивируемых р-клетках поджелудочной железы. Выделение и культивирование р-клеток проводилось по методу Б.МЫег и соавт. [9]. Островки р-клеток, полученные после переваривания коллагеназой мелко изрезанной поджелудочной железы самцов крыс линии Спрей Даули, высевались небольшими группами и подвергались инкубации с ферментом б^разе [8]. Клетки, полученные таким путем, увеличивали секреторную активность инсулина в 3 раза в среде, содержащей 10 мМ глюкозы. В дальнейшем эти клетки размещались в чашки Петри и культивировашсь в среде, содержащей 10% инактивированной сыворотки телят, 0,5% пенициллина и 0,5% стрептомицина в смеси 5% СОг/95% воздуха, в течение 1—10 дней при 37°С. Культивируемые клетки переносились механическим путем в среду, содержащую 140 мМ N- метил гли ка мид,

Рис. 1. Связывание ³Н-глибенкламида с микросомальной фракцией р-клеток в отсутствие (7) и в присутствии (2) 1 мкМ гли- бенкламида (А).

По оси ординат - концентрация связанного ’Н-глибенкламнда (в фмолях на 1 мг белка); по оси абсцисс - концентрация свободного ³Н -глибенкламида (в нМ). Вверху график Скетчарда, подтверждающий связывание ³Н-глибенкламида. По оси ординат - отношение связанного ³Н-глибенкламида к свободному; по оси абсцисс - концентрация связанного ’Н-глибенкламнда (в фмолях на 1 мг белка).

10 мМ КС1 с добавлением буфера 20 мМ НЕРЕЗ/ИаОН при pH 7,5 и 37°С. Суспензию диссоциированных клеток использовали для определения связывания в среде, содержащей 140 мМ N- метилгликамида, 1,8 мМ Са²⁺, 0,8 мМ MgCl^, 10 мМ КС1 в 20 мМ НЕРЕЗ/трис-буфера при pH 7,5 и 4°С.

Использовали меченный ³Н глибенкламид со специфической радиоактивностью 26,4 Ки/ммоль. Для определения связывания суспензию Р-клеток инкубировали при 4°С в растворе, содержащем ³Н-глибенкламид. Инкубация длилась 60 мин, после чего раствор фильтровался через фильтр jF/B (Whatman) с помощью вакуумного насоса. Фильтр промывали 100 мМ трис-НС1-буфе- ром при pH 7,5 и -4°С. Неспецифическое связывание определяли с помощью добавления 1 мкМ немеченого глибенкламида.

Микросомальная фракция была получена из инкубированных Р-клеток, промытых однократно на льду буфером, содержащим 0,3 М сахарозы, 40 мМ НЕРЕЗ/NaOII, которые затем были пятикратно гомогенизированы. Суспензию из этих клеток осаждали в течение 10 с и центрифугировали при 70 000g в течение 25 мин. Готовая для работы микросомальная фракция получалась после осаждения буфером, содержащим 20 мМ ПЕРЕЗ/ ИаоН при pH 7,5. Определение связывания глибенкламида с микросомальной ' фракцией было аналогично таковому с суспензией р-клеток. Связывание Н’-глибенкламида было пропорционально концентрации белка мембраны в пределах 0,2 и 1,2 мг/

мл.

Результаты и их обсуждение

Результаты наших исследований свидетельствуют о том, что сульфаниламидные рецепторы были биохимически идентифицированы с помощью меченого ³Н глибенкламида. Глибенкламид проявил себя как сильный лиганд для выявления сульфаниламидных рецепторов на (-клетках.

На рис. 1 и 2 представлены кривые, демонстрирующие связывание ³Н-глибенкламида с суспензией (-клеток, мембранами микросомальных фракций (клеток, а также блокаду этого связывания некоторыми гипогликемическими препаратами сульфаниламидного ряда. Обращают на себя внимание высокие показатели специфического связывания, тогда как неспецифическое связывание составляло всего лишь 8% (см. рис. 1). Скетчардовские кривые специфического связывания свидетельствуют о высоком сродстве мест связывания с глибенкламидом (Ка=0,3 нМ), с максимальной связывающей способностью (Вт_ах), равной 150 фмоль на 1 мг белка при 4°С. Специфическое связывание ³Н-глибенкла- мида с микросомальной фракцией р-клеток блокировалось высокими концентрациями немеченого глибенкламида, а также некоторыми другими сульфаниламидными препаратами. Наиболее активными из испытуемых нами гипогликемических препаратов, не считая глибенкламида, были глипизид и гликлазид.

Агалогичная последовательность по эффективности замещения ³Н-глибенкламида отмечена и в исследованиях авторов [12], которые использовали другие методы оценки действия гипогликемических препаратов. Применение иных препаратов, обладающих гипогликемическими свойствами, но не сульфаниламидного ряда, показало их неспособность влиять на связывание ЗН-глибенкламида с микросомами (-клеток. Это касается препарата под шифром НВ699, который является фрагментом глибенкламида. Полученные ранее [1, 2] данные по анализу действия сульфаниламидных препаратов на К⁺- АТФ-чувствительпые каналы Р-клеток подтверждены в настоящей работе.

В работе на суспендированных клетках при анализе степени ингибиции ЗН-глибенкламида использованными нами препаратами были получены аналогичные результаты. Эти вещества по степени активности располагались следующим образом: глибенкламид - глипизид — гликлазид.

Следует обратить также внимание на то, что связывание меченого глибенкламида интактными клетками было обратимо и, что очень важно, рецепторные места локализованы на стороне плазменной мембраны, число рецепторных мест составляло =5,120 на клетку.

Хорошая корреляция между данными по анализу рецепторных мест, измеряемых с помощью ³Н-гли- бенкламида, и данными литературы по оценке возможности глибенкламида блокировать выход рубидия из р-клетки, который отражает состояние К⁺- АТФ-чувствительных каналов, свидетельствует о том, что сульфаниламидные рецепторы тесно связаны с К⁺-АТФ-чувствительными каналами [10, 11]. Нельзя исключить возможность использования ’Н-глибенкламида при анализе молекулярных свойств К⁺- АТФ-чувствительных каналов не только на (-клетках поджелудочной железы, но и на сердечной и скелетных мышцах.

10

8

5

Рис. 2. Ингибирование гипогликемическими препаратами связывания ’Н-глибенкламида с микросомальной фракцией Р-клеток (я) и суспензией Р-клеток (б).

1 — глибенкламид, 2 — глипизид, 3 — гликлазид. По оси ординат - специфическое связывание ’Н-гл^1бенкламида (в % от максимума); по оси абсцисс — log концентрации препаратов.

В настоящее время, когда молекулярные и клеточные механизмы выделения инсулина под влиянием сульфаниламидных препаратов в своей основе изучены, тем не менее дискутируется вопрос о том, что не являются ли сульфаниламидные рецепторы на р-клетках К⁺-АТФ-чувствительными каналами. Характер действия сульфаниламидных препаратов, а также глюкозы и ее метаболитов на К⁺- АУФ-чувствительные каналы позволяет предположить ведущую роль ионных каналов в передаче сигналов, которые несут эти вещества. В р-клетках насчитывается несколько типов ионных каналов: 3 вида калиевые, кальциевые и натриевые каналы, которые каждый по-своему вносят вклад в возбудимость клетки. Использование техники пэтч-кламф [7] в из^ее^н^ ф5^нн^1^г^с^)н1^^1н^го соссоянн!^^ 1?азлич- ных чянных каналов, а также анализ степени прохождения сигнала через них подтверждают идею о том, что большая часть секретогенов инсулина, главным образом глюкоза и аминокислоты, должна метаболизироваться, чтобы вызвать выделение инсулина. Например, калиевые каналы закрываются под влиянием секретогенов инсулина, таких как глюкоза, манноза, глицеральдегид и лейцин [13, 14]. Добавление ингибиторов метаболизма, которые блокируют утилизацию отдельных субстратов, предотвращает ингибиторное действие на К⁺-каналы или вновь открывают К⁺-каналы, предварительно закрытые рядом секретогенов. К⁺-АУФ-чувствительные каналы блокируются сульфаниламидами в концентрациях, аналогичных тем, которые вызывают насыщение сульфаниламидных рецепторов. Сульфаниламидные препараты второй генерации, которые обладают большей активностью, чем секретогены инсулина, блокируют К⁺-АУФ-чувствительные каналы ч запускают выделение инсулина с одновременным оттоком К⁺ при низких наномолярных концентрациях.

Сопоставление данных о связывании сульфаниламидных препаратов с рецепторами (--леток и показателями ингибирования К⁺-АУФ-чувствительных каналов, полученными с помощью различных методических подходов, с данными о механизме запуска секреции инсулина предполагает, что сульфаниламидные рецепторы являются К+-АУФ-чувстви- тельными каналами. Такое предположение впервые было выдвинуто     и М .Ashford в 1985 г. [13].

Следует, однако, отметить, что секретогены из ряда сульфаниламидных препаратов, а также метаболиты глюкозы, блокируя К^АУФ-чувствительные каналы, проявляют свое действие через различные локусы клетки. Если сульфаниламидные препараты действуют на внутреннюю сторону плазменной мембраны, то АУФ действует на цитоплазматическую поверхность мембраны [2]. Концепция рецептора как ионного канала не нова, так как показано, что Иа⁺-канал в мышцах является нчкятчн-ацgтчлхолч- новым рецептором, а дигидропиридиновый рецептор — Са²⁺-каналом [2]. В обоих случаях специфические лиганды связываются с экстраклотячной частью канала [2].

Следует обратить внимание также на тот факт, что в механизме возникновения внутриклеточного сигнала значительная роль отводится АУФ и АДФ. Возможно, они выполняют двоякую функцию - регулируют работу ионных каналов и являются донорами фосфата в реакции фосфорилирования [4, 15, 16]. Оба нуклеотида присутствуют в (-клетках в незначительных количествах. Уак, концентрация АУФ в (-клетках составляет 3-5 мМ, необходимая же концентрация для блокады К⁺-каиалов намного выше. АДФ меняет чувствительность каналов к АУФ. В связи с этим становится ясным факт снижения эффективности действия АУФ в проявлении ингибиторных свойств сульфаниламидных препаратов при блокаде К⁺-каналов. Глюкоза же очень быстро меняет отношение АУФ/АДФ в (-клетках в сторону его увеличения. Уем самым допускается идея о том, что энергетическое состояние (-клеток — определяющий фактор в механизме секреции инсулина, а также то, что сульфаниламидные препараты оказывают свое действие на те же места в клетке, что и глюкоза [5, 6].

Анализ собственных и литературных данных позволяет утверждать, что увеличение выделения инсулина под влиянием сульфаниламидов обеспечивается за счет связывания их с высокоспецифическими рецепторами на мембране плазмы клеток. Уес- ное взаимодействие рецепторов и сульфаниламидных препаратов, предотвращая выход К⁺ и блокируя тем самым К⁺-АУФ-чувствительные каналы, запускает выделение инсулина. Кроме того, можно утверждать, что сульфаниламидные рецепторы (клеток являются и ионными каналами, а точнее, К⁺- АУФ-еувствительными каналами.

Выводы

1. Обнаружены и охарактеризованы рецепторы сульфаниламидных препаратов (глибенкламида, гли- пизида и гликлазида) на (-клетках поджелудочной железы.

Глибенкламид проявил себя наиболее активным из исследованных сульфаниламидных препаратов по показателю специфического связывания с рецепторами бета-клеток.