Репликативные и биохимические механизмы старения у женщин с синдромом Тернера

ОБОСНОВАНИЕ

За прошедшее столетие с момента первого описания профессором Н.А. Шерешевским внешних проявлений симптомокомплекса, включающего низкорослость, отсутствие вторичных половых признаков, короткую шею с крыловидными складками, низкий рост волос, микрогнатию, высокое небо и гипертелоризм сосков [1], клиницистами и цитогенетиками многих стран были определены фундаментальные вехи развития синдрома Тернера (СТ). В 1938 г. американский эндокринолог и по совместительству сотрудник Медицинского колледжа Университета Оклахомы (г. Оклахома-Сити, штат Оклахома, США) Генри Тернер (1892–1970) дополнил данный симптомокомплекс вальгусной деформацией локтевых суставов и дисгенезией яичников, благодаря чему его фамилия навсегда запечатлена в истории [2]. Таким образом, успехи советской и американской эндокринологических школ ознаменовали свершение первого исторического (клинико-описательного) этапа изучения данного синдрома. Принципиально новый, цитогенетический, этап, продолжающийся в наши дни, начался с сенсационной статьи руководителя лаборатории Medical Research Council (Харуэлл, графство Оксфордшир, Великобритания) Чарльза Эдмунда Форда (1912–1999) [3], который впервые определил моносомию по Х-хромосоме (45,Х0) как первопричину формирования классического варианта СТ. Нельзя забывать, что многогранность, мозаичность и нередкая стертость клинических проявлений (всего — около 60 фенотипических вариантов) зачастую приводят к поздней и случайной диагностике; например варианты 46,X,i(Xq) + мозаики с линиями клеток i(Xq); 46,X,del (Xq) + мозаики с линиями клеток del(Xq); 45X0/46XY; 45X/46XX) [4]. Кроме того, в середине 2000-х годов D. Keefe и соавт. [5] в ходе исследований in vitro наблюдали процесс формирования хромосомных/геномных аберраций, включавший в себя нарушение переплетения двух хроматид (хиазм) в профазе мейоза, аномалию веретена деления и укорочение концевых участков хромосом — теломер.

Теломеры (от др.-греч. τέλος — конец + μέρος — часть) служат концевыми структурами ДНК, состоящими из тандемных повторов нуклеотидных последовательностей TTAGGG на 3’-конце, в частности TPP1 [6]. Стабильность ДНК теломер поддерживается ревертазно-активным высокорегулируемым клеточным ферментом теломеразой [7], защищающей хромосомную ДНК от различных повреждений в течение всего клеточного цикла. По данным L. Gaydosh и соавт. (2020), статистически значимое протективное влияние на теломеры было обнаружено у эстрогенов in vitro [8], что подтверждается достижением более выраженной длины теломер к концу пубертата у женщин по сравнению с мужчинами (исходный показатель при рождении: 7,01±0,03 kb против 6,87±0,04, наблюдение: 6,79±0,03 против 6,65±0,03, Р=0,005) [9].

Характерная для классического кариотипа 45,X0 внутриутробная дисгенезия гонад, сопровождающаяся апоптозом предшественников половых клеток и заменой на волокнистую соединительную ткань (т.н. «гонадный тяж»), приводит к развитию врожденной преждевременной недостаточности яичников (ПНЯ) и тяжелого неятрогенного гипергонадотропного гипогонадизма [10]. На фоне первичной аменореи у пациенток с СТ также развивается тотальный эстрогенный дефицит, чреватый стремительным развитием заболеваний, ассоциированных со старением (атеросклероз, артериальная гипертония, дислипидемия, инсулинорезистентность, сердечно-сосудистые, неврологические, костно-мышечные заболевания) [11]. Эстрогенный дефицит при СТ — прямое показание к инициации пожизненной заместительной гормональной терапии (ЗГТ) [12].

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ

Изучить особенности маркеров репликативного клеточного старения (длина теломер лейкоцитов) и биохимических показателей (липидный профиль, кальциево-фосфорный обмен, функциональная активность щитовидной железы, маркеры цитолиза и холестаза, углеводный обмен, азотистый обмен, электролиты, фолликулостимулирующий гормон (ФСГ)) у женщин с СТ.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Место и время проведения исследования

Исследование проведено на базе ФГБУ «НМИЦ эндокринологии» Минздрава России совместно с МНОЦ «МГУ им. М.В. Ломоносова» в период с 10.01.2021 г. по 01.08.2022 г.

Дизайн исследования

В одномоментном сравнительном исследовании всего приняли участие 76 женщин, из них:

1.26 женщин (13–40 лет) с СТ (45,X0; 45,X/46,XX; 45,X/46,X,r(X)), получавших ЗГТ в циклическом режиме с дозой эстрогенового компонента 2 мг и дидрогестерона 10 мг.

2.26 женщин (18–39 лет) с преждевременной недостаточностью яичников (ПНЯ), получавших ЗГТ в циклическом режиме с дозой эстрогенового компонента 2 мг и дидрогестерона 10 мг.

3.24 здоровые женщины репродуктивного возраста.

Изучаемые популяции пациентов

Пациентки с СТ, получающие заместительную терапию половыми стероидами.

Критерии включения: пациентки женского пола паспортного возраста 13–40 лет; кариотип 45,X0; 45,X/46,XX; 45,X/46,X,r(X) — по данным медицинской документации. В анамнезе — факт получения ЗГТ в циклическом режиме с дозой эстрогенового компонента 2 мг и дидрогестерона 10 мг в течение не менее 5 лет. Пациентки (при недостижении возраста 18 лет — их родители) подписывали информированное согласие на проведение обследования и консультирование.

Критерии невключения.

1.Кариотип 45,XY.

2.После перенесенной химиотерапии.

3.После перенесенной лучевой терапии.

4.После комбинированного лечения из вышеперечисленных выше методов.

5.Наличие сопутствующей патологии в анамнезе:

5.1.нарушения функции щитовидной железы;

5.2.наличие официально задокументированных психических расстройств;

5.3.наличие официально задокументированных злокачественных новообразований;

5.4.нарушения углеводного обмена (нарушенная толерантность к глюкозе, нарушенная гликемия венозной плазмы натощак, сахарный диабет 1 и 2);

5.5.сердечно-сосудистые заболевания (ишемическая болезнь сердца (ИБС), острое нарушение мозгового кровообращения (ОНМК), тромбоэмболия легочной артерии (ТЭЛА)).

Способ формирования выборки — сплошной.

Пациентки с установленным диагнозом «Преждевременная недостаточность яичников», получающие заместительную терапию половыми стероидами >5 лет.

Критерии включения: пациентки женского пола паспортного возраста 18–39 лет, находящиеся в состоянии аменореи длительностью не менее 5 лет; подтвержденный медицинской документацией факт получения ЗГТ в циклическом режиме с дозой эстрогенового компонента эстрадиола 2 мг и дидрогестерона 10 мг в течение не менее 5 лет. Все пациентки подписывали информированное согласие на проведение обследования и консультирование.

Критерии невключения.

1.Наличие ятрогенной менопаузы в анамнезе:

1.1.после перенесенных хирургических вмешательств (кастрации);

1.2.после перенесенной химиотерапии;

1.3.после перенесенной лучевой терапии;

1.4.после комбинированного лечения из вышеперечисленных выше методов.

2.Наличие сопутствующей патологии в анамнезе:

2.1.генетическая патология репродуктивной системы (СТ, кариотип 45,X0/XY);

2.2.эстроген-зависимые заболевания и патологические состояния (гиперпластические процессы эндометрия, миома матки, все формы эндометриоза);

2.3.нарушения функции щитовидной железы;

2.4.наличие официально задокументированных психических расстройств;

2.5.наличие официально задокументированных злокачественных новообразований;

2.6.нарушения углеводного обмена (нарушенная толерантность к глюкозе, нарушенная гликемия венозной плазмы натощак, сахарный диабет 1 и 2);

2.7.сердечно-сосудистые заболевания (ИБС, ОНМК, ТЭЛА).

3.Другие физиологические состояния репродуктивной системы:

3.1.беременность;

3.2.период грудного вскармливания.

Способ формирования выборки — произвольный.

Здоровые женщины репродуктивного возраста без заболеваний репродуктивной системы.

Критерии включения: пациентки женского пола с сохраненным менструальным циклом; уровень ФСГ в фолликулярную фазу — в пределах 2,0–11,6 МЕ/л. Все пациентки подписывали информированное согласие на проведение обследования и консультирование.

Критерии невключения.

1.Наличие физиологической менопаузы в анамнезе.

2.Наличие ятрогенной менопаузы в анамнезе:

2.1.после перенесенных хирургических вмешательств (кастрации);

2.2.после перенесенной химиотерапии;

2.3.после перенесенной лучевой терапии;

2.4.после комбинированного лечения из вышеперечисленных выше методов.

3.Наличие сопутствующей патологии в анамнезе:

3.1.генетическая патология репродуктивной системы (СТ, кариотип 45,X0/XY);

3.2.наличие аутоиммунной менопаузы в анамнезе (в исходе первичной недостаточности яичников);

3.3.эстроген-зависимые заболевания и патологические состояния (гиперплазия эндометрия, миома матки, все формы эндометриоза);

3.4.нарушения функции щитовидной железы;

3.5.наличие официально задокументированных психических расстройств;

3.6.наличие официально задокументированных злокачественных новообразований;

3.7.нарушения углеводного обмена (нарушенная толерантность к глюкозе, нарушенная гликемия венозной плазмы натощак, сахарный ­диабет 1 и 2);

3.8.сердечно-сосудистые заболевания (ИБС, ОНМК, ТЭЛА).

4.Другие физиологические состояния репродуктивной системы:

4.1.беременность;

4.2.период грудного вскармливания.

Способ формирования выборки — произвольный.

Описание вмешательства

Пациенткам проведены лабораторный генетический (длина теломер лейкоцитов), биохимический анализы.

Экстракция ДНК проведена набором Qiagen DNA blood mini kit (Германия).

Антропометрическое исследование — длина тела, масса тела.

Оценка длины теломер лейкоцитов — методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени (алгоритм Flow-fish).

Дизайн исследования

Обсервационное одномоментное сравнительное ретроспективное исследование.

Статистический анализ

Статистическая обработка данных выполнена с помощью программы IBM SPSS Statistics (version 26,0 for Windows).

Категориальные переменные представлены в виде абсолютных и относительных частот. Количественные показатели оценивались на предмет соответствия нормальному распределению с помощью критерия Шапиро–Уилка. В случае отсутствия нормального распределения количественные данные описывались с помощью медианы (Me) и нижнего и верхнего квартилей (Q¹–Q³). При нормальном распределении — средними значениями и стандартным отклонением. Сравнение двух групп по количественному показателю, распределение которого отличалось от нормального, выполнялось с помощью U-критерия Манна–­Уитни. При нормальном распределении использовался t-критерий Стьюдента. Анализ многопольных таблиц сопряженности выполнялся с помощью точного критерия Фишера. Корреляция между переменными была проверена с помощью корреляционного анализа по методу ρ Спирмена. Прогностическая модель, характеризующая зависимость количественной переменной от факторов, разрабатывалась с помощью метода линейной регрессии.

Этическая экспертиза

Протокол исследования был одобрен этическим комитетом НМИЦ эндокринологии (№11 от 22.07.2021).

РЕЗУЛЬТАТЫ

Клинико-лабораторные (биохимические и генетические) данные пациенток с неятрогенным гипергонадотропным гипогонадизмом в исходе СТ (кариотип 45,X0) представлены в табл. 1.

С целью более наглядного сопоставления длин теломер у исследуемых групп (СТ/ПНЯ) в качестве референсных показателей мы также привели аналогичные показатели здоровых женщин репродуктивного возраста (контрольная группа, n=24). Медиана возраста в данной группе составила 36,5 [ 28,5–40,5] года, ИМТ — 21,8 [ 20,2–27,2] кг/м², ФСГ — 5,8 [ 4,6–8,6] мМЕд/л, длина теломер — 10,77 кБ [ 9,95–13,16], минимум — 8,78, максимум — 14,91.

Все пациентки с ПНЯ (n=26) с момента установления данного диагноза получали ЗГТ, средний срок приема составил 3,0 [ 2,0–5,5] года.

Нами был проведен корреляционный анализ взаимосвязи длины теломер и длительности приема ЗГТ у женщин с ПНЯ. Установлена прямая статистически значимая корреляционная связь умеренной силы (ρ=505; p<0,001).

Исходя из вышеуказанного анализа данных, наблюдаемую зависимость такого маркера клеточного старения, как длина теломер, от количества лет приема ЗГТ можно описать прогностической моделью (уравнением) линейной регрессии:

Z_{Длина теломер оконч, кБ} = 0,216 × X_{прием ЗГТ, лет} + Y_{Длина теломер начальная}, кБ + 9,49

При увеличении приема ЗГТ на 1 год следует ожидать увеличения длины теломер на 0,216 (p <0,001) кБ.

Подтверждение данной прогностической модели хорошо прослеживается у пациенток с ПНЯ, длина теломер которых (на фоне приема ЗГТ) оказалась приближена к референтным нормам здоровых женщин (10,34 [ 8,41–13,08] у женщин с ПНЯ и 10,77 [ 9,95–13,16] у здоровых женщин, р>0,05).

У пациенток с СТ по сравнению с ПНЯ, согласно табл. 1, отмечается статистически значимая тенденция к более низкому уровню липопротеинов высокой плотности (р=0,004), витамина D (p<0,001) при более высоком уровне фосфора сыворотки вплоть до верхней границы референсных значений (p<0,001); более высокому уровню трансаминаз, лабораторным показателям холестаза (ГГТ), триглицеридов, ФСГ (р<0,001), липопротеинов низкой плотности (р=0,01). Также была проведена стратификация показателей длины теломер в исследуемых группах по возрастному критерию (см. табл. 2)

ОБСУЖДЕНИЕ

СТ — генетическое заболевание, которое выявляется у 50 из 100 000 новорожденных девочек и отрицательно влияет на прогноз продолжительности и качества жизни [13]. Соматический статус при данном заболевании разнообразен, всегда имеет коварный и необратимый характер за счет сопутствующих кардиоваскулярных (двухстворчатый аортальный клапан, коарктация аорты, удлинение интервала Q–T), ортопедических (аномальная низкорослость, сколиотические деформации позвоночника), оториноларингологических (тугоухость вплоть до глухоты), патологий, а также нарушений мочевыводящей (почечные мальформации), репродуктивной (первичная аменорея, в ряде случаев — задержка полового развития), эндокринной (метаболический синдром, хронический аутоиммунный тиреоидит, дефицит витамина D, остеопороз) и других систем [14].

Репрезентативность выборок

В оригинальном исследовании задействован относительно малый объем выборки, что объясняется редкой встречаемостью гипергонадотропного гипогонадизма дисгенетического (СТ) и аутоиммунного характера (ПНЯ) в общей популяции. Кроме того, на итоговый объем выборки серьезным образом повлиял принцип строгого соблюдения критериев включения и (по данным анамнеза и катамнеза) во избежание искажения конечных результатов.

Сопоставление с другими публикациями

Еще задолго до внедрения современных принципов научной методологии проводились исследования, посвященные сердечно-сосудистым рискам у пациенток с СТ. Согласно данным многолетнего (с 1977 по 2017 г.) клинического исследования на базе кардиохирургической клиники Mayo Clinic Rochester, из группы, состоящей из 281 пациентки, отобраны 51 пациентка (средний возраст — 28 лет, вариабельность от 8 до 41), прошедшая по крайней мере 1 плановое кардиохирургическое вмешательство [15]. Данное исследование наглядно иллюстрирует факт наличия у пациенток с СТ (45,X0) обширного спектра сочетанных терапевтических и кардиохирургических патологий, в т.ч. их комбинаций [15]. Кроме того, наличие СТ ухудшает прогноз пациенток в отношении состояния углеводного обмена: по данным S.M. Davis и M.E. Geffner (2019), при данной нозологии риск сахарного диабета 1 и 2 типов в 11,56 и 4,38 раза выше, чем в общей популяции, соответственно [16].

Одной из первых работ по биологии теломер in vivo у лиц с СТ стало исследование М. Kveiborg и соавт. (2001), выполненное в г. Орхус, Дания. Техническая часть включала в себя оценку скорости укорочения длины теломер (RTFL, Telomere Restriction Fragment Length) у пациенток молодой/старшей возрастных групп с СТ (45,X0; n=30) и нормальным кариотипом (46,XX; n=30) [15]. Убедительных статистически значимых данных за ускоренное укорочение теломер в молодой (СТ: 7011±521 vs. контроль: 7285±917 bp, р=0,3) и старшей возрастных группах (TS: 7357±573 vs. контроль: 7221±621 bp, р=0,6) найдено не было [17]. Отсутствие подтверждения первоначальной гипотезы можно объяснить малым объемом выборки (n=60), что, в свою очередь, является логичным следствием временной, финансово-технической ограниченности и трудностей в наборе основной группы.

Клиническая значимость результатов

ЗГТ половыми стероидами у женщин с гипергонадотропным гипогонадизмом — собирательное понятие, объединяющее фармакологическую компенсацию эстрогенного дефицита как физиологического (менопаузального), так и патологического (ПНЯ, СТ, нарушение формирования пола) генеза. Ее основной задачей является восстановление уровня эстрогенов до показателей репродуктивного периода. В основе данного эмпирического подхода лежит многолетний клинический опыт ведения пациенток с манифестацией возраст-ассоциированных заболеваний в период менопаузы. В свете ориентированности научного сообщества на принципы персонализированной медицины теломеразная теория старения в ближайшей и отдаленной перспективе будет занимать особое место в повестке дня.

Ограничения исследования

Наиболее вероятным и потенциально устранимым фактором, ограничивающим данное исследование, является относительная узость выборки ввиду высокой финансовой-технической емкости технологий определения длины теломер, доступных на настоящий момент специалистам в Российской Федерации.

Направления дальнейших исследований

В перспективе мы предполагаем достоверно определить характер влияния ЗГТ половыми стероидами на длину теломер через проведение биопсии (пункции) яичников и последующее определение длины теломер. На сегодняшний день данная идея пока остается трудноосуществимой на практике с этической и финансово-технической точек зрения.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Результаты данного исследования имеют научную ценность, являются показательными, но в то же время не исчерпывающими сами по себе. Только при условии проведения двухмоментных слепых плацебо-контролируемых рандомизированных клинических исследований (РКИ) среди обширных выборок пациенток с СТ результаты могут приобрести практическую ценность для специалистов. Проведение РКИ у пациенток с СТ — неотъемлемая часть разработки эффективных мер по персонализированной фармакологической компенсации данной категории больных в будущем.

ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ

Источник финансирования. Исследование проводится в рамках Государственного задания: «Влияние эпигенетических факторов на течение менопаузы у женщин с эндокринопатиями аутоиммунного генеза в рамках формирования модели “здорового старения”», регистрационный номер АААА-121030100033-4.

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Участие авторов. Все авторы одобрили финальную версию статьи перед публикацией, выразили согласие нести ответственность за все аспекты работы, подразумевающую надлежащее изучение и решение вопросов, связанных с точностью или добросовестностью любой части работы.