Исследование стероидного профиля слюны методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с тандемным масс-спектрометрическим детектированием у детей с врожденной дисфункцией коры надпочечников

ОБОСНОВАНИЕ

В настоящее время общепринятыми маркёрами оценки адекватности терапии врожденной дисфункции коры надпочечников (ВДКН) у детей являются уровни 17-гидроксипрогестерона, андростендиона и тестостерона в сыворотке крови методом иммуноферментного анализа (ИФА) [1][2]. Данный метод имеет ряд ограничений: неудовлетворительную специфичность, включающую возможность завышения результатов из-за «перекрестной реакции» с другими близкими по строению стероидами, такими как 17-гидроксипрегненолон, либо их занижение в результате так называемого хук-эффекта [3][4][5]. Кроме того, данная методика не позволяет одновременно оценивать концентрацию других андрогенов, которые являются важными маркерами адекватности подбора терапии и ограничивается определением только одного показателя за один анализ [6].

Высокоэффективная жидкостная хроматография с тандемным масс-спектрометрическим детектированием (ВЭЖХ-МС/МС) может устранить эти недостатки. Преимущества метода ВЭЖХ включают хроматографическое разделение стероидов, что минимизирует или полностью исключают интерференции со сходными по строению соединениями, а масс-спектрометрия обеспечивает высокую селективность и чувствительность за счет идентификации молекул по их молекулярным массам. Использование метода MRM (multiple reaction monitoring) в тандемной масс-спектрометрии повышает селективность и позволяет точно количественно анализировать множество стероидов в ходе одного анализа [7][8]. Это значительно расширяет возможности мониторинга терапии ВДКН в рамках одного исследования. Кроме того, возможной причиной завышения результатов может быть «стрессорная реакция» на забор венозной крови, что особенно актуально для пациентов детского возраста. С целью преодоления данной проблемы разрабатываются малоинвазивные методы оценки стероидного профиля [9–12]. Один из таких методов предполагает использование слюны в качестве биологического материала для определения стероидов методом ВЭЖХ-МС/МС [13–16].

Существует несколько методик сбора слюны, например: пассивное слюнотечение и применение тампонов для сбора образца [17]. В ходе ранее проведенного на базе нашего центра сравнительного анализа методов сбора слюны у пациентов с ВДКН установлено, что использование сорбирующих материалов для сбора слюны в большинстве случаев приводит к занижению результатов [18]. Также было установлено, что наиболее предпочтительным методом сбора слюны для оценки стероидного профиля является «пассивное стекание» в полипропиленовые пробирки. Более того, в группе пациентов с ВДКН и здоровых добровольцев проведена оценка корреляции между концентрациями стероидов в соответствующих образцах крови и слюны. Выявленная в результате исследования корреляция для некоторых, критически важных для диагностики и коррекции терапии при ВДКН андрогенов, оказалась умеренной или слабой, что может быть обусловлено малой выборкой и требует увеличения численности групп пациентов с ВДКН [18].

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ

Целью исследования стала оценка корреляции между концентрациями стероидных гормонов в крови и слюне в пубертатной и допубертатной группах пациентов с ВДКН методом ВЭЖХ-МС/МС.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Место и время проведения исследования

ГНЦ РФ ФГБУ «НМИЦ эндокринологии» Минздрава России (далее: ФГБУ «НМИЦ эндокринологии»).

Время исследования

Октябрь 2024 г. 

Изучаемые популяции (одна или несколько)

Популяция: пациенты детского возраста, проходившие плановое стационарное обследование в ФГБУ «НМИЦ эндокринологии» с установленным диагнозом «ВДКН (классический дефицит 21-гидроксилазы)».

Критерии включения: пациенты до 17 лет включительно с диагнозом «Врожденная дисфункция коры надпочечников дефицит 21-гидроксилазы», проходившие плановое стационарное обследование в ФГБУ «НМИЦ эндокринологии».

Критерии исключения: пациенты без врожденной дисфункции коры надпочечников.

Способ формирования выборки из изучаемой популяции

Сплошной способ формирования выборки.

Дизайн исследования:

• одноцентровое;
• интервенционное;
• одномоментное.

Методы

Для корреляционного анализа между концентрациями стероидов в образцах слюны и сыворотки методом ВЭЖХ-МС/МС образцы соответствующего биоматериала были собраны у 45 пациентов с установленным диагнозом «ВДКН (классический дефицит 21-гидроксилазы)» в возрасте от 3 до 17 лет (медиана 13) обоих полов, проходящих плановое стационарное обследование и получающих заместительную терапию глюкокортикоидами (гидрокортизон, преднизолон, дексаметазон) и минералокортикоидами (флудрокортизон). Согласно оценке полового развития были сформированы 2 группы: допубертатная и пубертатная. Характеристики обеих групп представлены в таблице 1. Два родных брата допубертатного возраста (младше 9 лет) были распределены в пубертатную группу в связи с наличием пубертатной стадии полового развития, что было подтверждено высоким уровнем ЛГ в ходе стимуляции аналогами ГнРГ. Образцы слюны собирались методом «пассивного стекания» натощак, в полипропиленовые пробирки типа «эппендорф», с предварительным полосканием рта водой за 10 минут до сбора образца. Затем слюна из собранных образцов была аликвотирована в полипропиленовые пробирки объемом от 450 до 950 мкл (в зависимости от собранного объема), которые после этого подвергались заморозке при -80 °С в центре биобанкирования ФГБУ «НМИЦ эндокринологии». Перед анализом образцы размораживали при комнатной температуре и центрифугировали; для анализа использовали супернатант.

Непосредственно после сбора слюны у пациентов производили забор венозной крови в пробирки с активатором сгустка, которые затем центрифугировали для получения сыворотки. Сыворотку аликвотировали в отдельные пробирки и также замораживали при температуре -80 °С. Перед анализом сыворотку размораживали при комнатной температуре и перемешивали на шейкере.

Оборудование и реагенты

Аналитические стандарты: в качестве внешних стандартов в работе были использованы 11-дезоксикортизол (Steraloids, USA), 17-гидроксипрогестерон (Steraloids, USA), кортизол (Steraloids, USA), кортизон (CIL, USA), 21-дезоксикортизол (Steraloids, USA), андростендион (Steraloids, USA), дегидроэпиандростерон (Steraloids, USA), тестостерон (Steraloids, USA), прогестерон (Steraloids, USA); в качестве внутренних стандартов были использованы кортизол-d₄ (CIL, USA), прогестерон-¹³С₃ (CIL, USA), дегидроэпиандростерон-d6, 17-OH-прогестерон¹³C₃ (CIL, USA), 11-дезоксикортизол-d₅ (CIL, USA), 21-дезоксикортизол-d₈ (CIL, USA), кортизон-d₇ (CIL, USA).

Реагенты: метанол (для УФ, ИК, ВЭЖХ, МС, титрования, EvaScience, Россия), этилацетат (Sigma-Aldrich, for LC-MS, Germany). Деионизированная вода была приготовлена в системе водоочистки Milli-Q Advantage A10 (Millipore, Франция), сульфат цинка (99,0-100,5%, EMPROVE, Merck, Германия).

Материалы для сбора слюны: пробирки типа эппендорф (SHANGYU YITE PLASTIC LIMITED, Китай), центрифужные пробирки (Thermo Scientific, Corning, США).

Материалы для сбора крови: пробирки с разделительным гелем для сыворотки BD Vacutainer® SST™II Advance (Becton Dickinson, Нидерланды).

Оборудование: для анализа использовалась система ВЭЖХ-МС/МС, состоящая из хроматографа Agilent 1290 Infinity II (Agilent Technologies, США), укомплектованного четырехканальным насосом со смесителем низкого давления, автосемплером и термостатом колонок, а также масс-спектрометра AB Sciex QTrap 5500 (AB Sciex, Сингапур) c источником ионизации TurboV, способного работать в режиме химической ионизации при атмосферном давлении (ХИАД). Хроматографическое разделение проводили на колонке xSelect HSS С18 2,5 мкм, 3,0×75 мм с размером частиц 2.5 мкм (Waters, Ирландия).

Пробоподготовка образцов слюны

Пробоподготовку всех образцов слюны проводили в соответствии с методикой, описанной нами ранее [18]. К 500 мкл слюны добавляли 5 мкл внутреннего стандарта и 900 мкл этилацетата. После перемешивания и центрифугирования отбирали верхний органический слой, упаривали досуха и растворяли в 110 мкл смеси метанола и воды (30:70) перед анализом.

Пробоподготовка образцов сыворотки крови

Пробоподготовку образцов сыворотки проводили аналогично методике, описанной ранее [19]. В аликвоту сыворотки объемом 300 мкл добавляли 30 мкл внутреннего стандарта, 150 мкл 0,1M раствора сульфата цинка и 200 мкл метанола. После перемешивания и центрифугирования надосадочную жидкость упаривали до удаления органического растворителя, после добавляли 500 мкл этилацетата. После перемешивания и центрифугирования отбирали верхний органический слой, упаривали досуха и растворяли в 110 мкл смеси метанола и воды (30:70) перед анализом.

Условия хроматографического разделения

Хроматографическое разделение проводили в градиентном режиме с использованием двухкомпонентного градиента на основе метанола и воды. Скорость потока составляла 0,4 мл/мин, температура колонки 40 °C, объем пробы — 80 мкл. Для разделения использовали градиентную программу с изменением содержания обоих компонентов подвижной фазы: повышение содержания метанола от 50 до 60% с начала анализа за 6 минут, затем повышение до 90% за 3 минуты и выдержка при этих условиях в течение 2 минут, после возвращение к условиям начала анализа за 1 минуту и уравновешивание колонки в течение 3 минут.

Условия масс-спектрометрического детектирования

Для детектирования хроматографического потока использовали трехквадрупольный масс-спектрометр, оснащенный источником химической ионизации при атмосферном давлении. Ионизацию компонентов проводили в режиме регистрации положительных ионов, ток иглы коронного разряда устанавливали на значение 5 мкА, давление газа в области распыления составляло 50 psi (фунт/дюйм²), газа-завесы 28 psi, температура нагревателя источника 500 °C. Регистрация компонентов осуществлялась в режиме мониторинга множественных реакций (multiple reaction monitoring, MRM), работающем в заданных временных интервалах. Временной интервал для каждого компонента составлял 90 сек., время сканирования всех MRM-переходов — 1 сек. Параметры были подобраны для каждого компонента индивидуально. Управление, сбор и обработку количественных данных осуществляли при помощи программного обеспечения Analyst 1.6.3 (AB Sciex).

Статистический анализ

Статистический анализ выполнен с помощью программного обеспечения SAS OnDemand for Academics. Описательная статистика количественных признаков представлена в виде медиан, первых и третьих квартилей; категориальных — в виде абсолютных и относительных частот. Корреляционный анализ выполнен с помощью метода ранговой корреляции Спирмена. Уровень статистической значимости принят равным 0,05.

Этическая экспертиза

Исследование одобрено локальным этическим комитетом «НМИЦ эндокринологии №4 от 22.02.2023.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Был проведен корреляционный анализ между концентрациями стероидов в образцах крови и слюны в допубертатной и пубертатной группах (табл. 2).

В результате корреляционного анализа стероидного профиля в допубертатной группе выявлена сильная положительная корреляция между концентрациями стероидов в образцах сыворотки и слюны для: 17ОН-прогестерона (р<0,001; r=0,88), андростендиона (р<0,001; r=0,84) и дигидроэпиандростерона (р=0,001; р=0,78) (рис. 1).

В пубертатной группе выявлена сильная положительная корреляция между концентрациями стероидов в образцах сыворотки и слюны для 17ОН-прогестерона (р<0,001; r=0,94), андростендиона (р=<0,01; r=0,94), тестостерона (р<0,001; r=0,94) и прогестерона (р<0,001; r=0,79), а также умеренная корреляция для 21-дезоксикортизола (р=0,003; r=0,52) (рис. 2).

ОБСУЖДЕНИЕ

Использование слюны для определения стероидного профиля у пациентов с ВДКН в качестве альтернативного биоматериала в сравнении с сывороткой крови обладает рядом преимуществ, таких как: исключение «стрессорной реакции» при венепункции и снижение нагрузки на средний медицинский персонал, так как образцы слюны могут быть собраны самостоятельно пациентом в домашних условиях. Как любой, метод определения стероидов в слюне обладает рядом недостатков: трудности сбора слюны в определенных возрастных группах (дети раннего возраста), низкие концентрации интересуемых стероидов в слюне [17][20].

В рамках данного промежуточного исследования возможности использования слюны как альтернативного биоматериала для диагностики и оценки компенсации ВДКН, мы получили сопоставимые с ранее опубликованными исследованиями зарубежных авторов результаты для концентраций 17ОН-прогестерона, тестостерона и андростендиона [13][14].

Исходя из полученных результатов, можно сделать вывод о том, что для большинства интересующих нас стероидов имеется сильная положительная корреляция между концентрациями стероидов в образцах сыворотки и слюны. По всей видимости, отсутствие сильной корреляции для 21-дезоксикортизола в пубертатной группе связано с низкой выборкой пациентов.

В настоящее время имеются референсные интервалы гормонов стероидного профиля сыворотки для различных возрастных групп. В перспективе, исходя из коэффициентов корреляции или из регрессионных моделей, мы планируем вывести формулу перерасчета референсных интервалов концентрации стероидных гормонов для сыворотки в соответствующие показатели для слюны, однако, отсутствие нормального распределения данных при текущем размере выборки, требуется существенного увеличения ее объема.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Для большинства стероидов, используемых для диагностики и контроля терапии пациентов с ВДКН, выявлена сильная или умеренная корреляция между концентрациями стероидов в соответствующих образцах сыворотки и слюны. Для выведения формулы перерасчета референсных интервалов концентрации стероидных гормонов сыворотки в соответствующие показатели слюны необходимо расширение выборки пациентов.

ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ

Источники финансирования. Данная работа была финансово поддержана Министерством здравоохранения Российской Федерации, исследование образцов слюны у детей проводилось в рамках государственного задания № 123021000036-2.

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с содержанием настоящей статьи.

Участие авторов. Все авторы одобрили финальную версию статьи перед публикацией, выразили согласие нести ответственность за все аспекты работы, подразумевающую надлежащее изучение и решение вопросов, связанных с точностью или добросовестностью любой части работы.

Благодарности. Работа выполнена с использованием материалов Уникальной научной установки «Коллекция биологического материала пациентов с эндокринными патологиями» ГНЦ РФ ФГБУ «НМИЦ эндокринологии им. академика И.И. Дедова» Минздрава России (Москва, Россия).