Универсальная и комплексная энзимология ароматазы

Биосинтез эстрогенов осуществляется в различных органах и тканях большинства позвоночных обоего пола [1]. У самок позвоночных и у женщин эстрогены синтезируются главным образом в яичниках (клетки зернистого слоя фолликулярного эпителия) [2], а также в жировой ткани, эндометрии матки, головном мозге (миндалевидное тело, предоптический отдел, гипоталамус), плаценте, корковом веществе надпочечников, в фибробластах кожи, мышцах и клетках костной ткани [3—7]. У самцов позвоночных и у мужчин синтез эстрогенов имеет место в жировой ткани, головном мозге (в тех же отделах, что и у самок позвоночных и женщин), семенниках (в клетках Лейдига и в клетках Сертоли), корковом веществе надпочечников, фибробластах кожи, мышцах и клетках костной ткани [3—6, 8, 9].

Эстрогены синтезируются из андрогенов. Превращению подвергаются андростендион, тестостерон и реже — их 16-гидроксипроизводные [10]. Андростендион превращается в эстрон, тестостерон — в эстрадиол, а их 16-гидроксипроизводные — в 16- оксиэстрон и эстриол соответственно [11].

Несмотря на то что в яичниках каталитическому действию ароматазы подвергается главным образом тестостерон, основным ее субстратом в организме в целом является андростендион. Это обусловливает преимущественное экстрагонадное образование эстрона, который затем может быть восстановлен в более мощный эстроген — эстрадиол — при участии 17~гидроксистероиддегидрогеназы. Ароматаза гидроксилирует субстрат в положении 19 (трижды) и в положении 2 (однократно), что приводит к отщеплению 19-го углеродного атома, сопровождающемуся ароматизацией первого кольца стероидного ядра [10, 12—23].

Схема, обобщающая ароматазную реакцию и биосинтез эстрогенов, представлена на рис. 1.

Мол. масса фермента составляет 55 кД [24]. Гем в структуре ароматазы удерживается тиоловыми группами остатков цистеина, т. е. является ти- олсвязанным [25, 26]. Пятый координационный лиганд геминового железа, обусловливающий максимум светопоглощения гемопротеида (450 нм), является тиолатным анионом в составе консервативного цистеина 437, находящегося в гемсвязы- вающей области ароматазы [27]. При разрушении фермента он, как и все изоформы цитохрома Р- 450, превращается в цитохром Р-420 (максимум светопоглощения 420 нм). Превращение фермента из формы Р-450 в форму Р-420 является первой стадией его распада. Переход цитохрома Р-450 в цитохром Р-420 обусловлен замещением тиолатно- го аниона имидазольной группой гистидина, в результате которого фермент утрачивает каталитическую активность [28].

Ароматаза, как и другие изоформы цитохрома Р-450, является гемопротеидом. В настоящее время известно, что аминокислотная последовательность изученных изоформ идентична примерно на 20% [28, 29]. Кристаллографические исследования большого количества изоформ цитохрома Р-450 показали, что, несмотря на такую вариабельность, общая топография и конформация ферментов данного суперсемейства сходны. Наибольшее сходство наблюдается в структуре участка апофермента, ответственного за связывание гема, что обусловливает общность механизма транспорта электронов и протонов, а также активации кислорода для всех изоформ цитохрома Р-450 [30]. Установлено, что аминокислотная последовательность ароматазы примерно на 30% гомологична по отношению к другим изоформам цитохрома Р-450, а с ферментами данной группы, участвующими в стероидогенезе, она сходна всего на 17,9—23,5 % [31]. Данная гомология распространяется именно на гемсвязывающий регион фермента [32].

Ароматаза является мономерным мембраносвязанным ферментом, как и все эукариотические изоформы цитохрома Р-450 [33]. Наиболее охарактеризованной является ароматаза лошади и человека. Фермент состоит из 503 аминокислотных остатков [34—36] и имеет атипичный N-конец по сравнению с другими микросомальными изоформами цитохрома Р-450. Микросомальные изоформы цитохрома Р-450 характеризуются гидрофобным N-концом, выполняющим функцию "заяко- ривания" фермента на мембране, в то время как у ароматазы гидрофобным является только субдомен С в составе N-конца. Ему предшествует более гидрофильный субдомен В, что нетипично для других микросомальных изоформ цитохрома Р-450. Субдомен В в структуре N-конца ароматазы содержит последовательности, способные формировать амфифильную спираль. Субдомен С непосредственно входит в мембрану, в то время как субдомен В, содержащий два кислых аминокислотных остатка, препятствует дальнейшему вхождению фермента в мембрану и "заякоривает" его [37].

Следует отметить, что ароматаза форели содержит в своем N-конце 19 дополнительных аминокислотных остатков, формирующих субдомен А, который в целом гидрофобен. Однако из-за наличия в данном субдомене аргинина в положении 10 он может лишь частично внедряться в мембрану [37]. Положение субдоменов N-конца ароматазы (включая субдомен А) в мембране показано на рис. 2.

Исследование структурной организации ароматазы представляет особый интерес, так как играет первостепенную роль в поиске высокоспецифичных ингибиторов данного фермента, что необходимо для химиотерапии эстрогензависимых злокачественных новообразований.

Наиболее приемлемым путем выявления новых ингибиторов ароматазы человека in vitro является скрининг химических соединений, основанный на данных о структуре субстрата, а также на сравнительном анализе их воздействия на ароматазу, выделенную из источников животного происхождения. Дизайн наиболее специфичных и используемых в медицинской практике ингибиторов ароматазы можно улучшить при наличии исчерпывающих данных о структуре ее активного центра. В связи с этим моделирование данной части ароматазной молекулы, равно как и всего белка в целом, является необходимым [34].

Данные о структуре ароматазы были получены во многом благодаря сравнительному анализу с растворимыми бактериальными цитохромами — цитохромом P-450camphor (P-450cam), выделенным из Pseudomonas putida, цитохромом Р-450ВМ- 3, полученным из Bacillus megaterium, а-терпено- ловым цитохромом Р-450 Pseudomonas putida (Р- 450terp) и цитохромом Р-450, конвертирующим эритромицин F (P-450eryF) Saccharopolyspora erythreae, которые были получены в кристаллическом виде и хорошо охарактеризованы [38—42]. Главной основой для построения структурной модели ароматазы служил цитохром Р-450ВМ-3 [18].

Теоретическая молекулярная модель ароматазы была предложена S. Graham- Lorence и соавт. [18]. С использованием координатных систем были рассчитаны расположения электростатических и ван- дер-ваальсовых взаимодействий. Эта модель в целом отражает структурную организацию фермента, хотя в недостаточной степени характеризует участок между 150-м и 250-м аминокислотными остатками [34]. Для более полной характеристики молекулярной структуры ароматазы и выявления аминокислотных участков, необходимых для связывания субстрата, Р. Auvray и соавт. [34, 43] использовали иной методический подход — сайт-специфич- ный мутагенез, предполагавший замену определенных аминокислотных остатков на близкие по размеру, но отличные по свойствам. В основу такого мутагенеза положена полимеразная цепная реакция с двумя комплементарными нуклеотидными праймерами, содержащими мутацию. Реакцию проводили с использованием Pfii ДНК полимеразы в течение 16 циклов. Было установлено, что Лиз130, Фен134, Асп309 и Асп476 непосредственно выполняют связывание субстрата (в качестве примера на рис. 3 приведено положение андростендиона в связывающем центре ароматазы). Также в связывании субстрата принимают участие Иле474 и Гис475. Наиболее критическими для поддержания конформации фермента являются Фен320 и Сер470 [34].

Механизм каталитического действия ароматазы

Биосинтез стероидных гормонов происходит главным образом на микросомах и сводится к реакциям гидроксилирования их стероидных предшественников, приводящим к отщеплению алифатических радикалов и образованию полярных продуктов, а также к дегидрогеназным реакциям, обеспечивающим взаимопревращения гидроксильных и кетогрупп [44]. Реакции гидроксилирования осуществляют изоформы цитохрома Р-450, являющиеся конечным пунктом микросомальной цепи переноса электронов [45]. Акцептируя электроны, изоформы цитохрома Р-450 осуществляют гидроксилирование субстрата. Цепь переноса электронов к каталитическому центру ферментов может включать различные компоненты, на основании чего цитохромы Р-450 делятся на четыре основных класса [29]. Ароматаза является представителем четвертого класса изоформ цитохрома Р-450, акцептирующим электроны от НАДФН+Н⁺ при участии НАДФН+Н⁺-зависимой цитохром P-450-pe- дуктазы [23, 31, 46, 47].

На рис. 4 представлен механизм каталитического гидроксилирования субстрата, являющийся общим для всех изоформ цитохрома Р-450 [28, 29] независимо от состава цепи переноса электронов. Он включает следующие основные этапы [16]. Геминовое железо, находясь в окисленном состоянии (Fe³⁺), акцептирует один электрон от НАДФН+Н⁺, приобретая степень окисления Fe²⁺. Восстановившись, железо передает электрон кислороду, в результате чего последний превращается в супероксидный радикал [48], способный взаимодействовать с Fe³⁺ в составе цитохрома Р-450. После связывания Fe³⁺ с супероксидом образуется неустойчивый комплекс FeOO^-, который протонируется с образованием FeOOH. Второй электрон, поставляемый НАДФН+Н⁺-зависимой цитохром Р-450- редуктазой, разрушает пероксидную связь в составе комплекса FeOOH с образованием радикала FeO* и гидроксил-аниона, акцептирующего протон с образованием воды. Радикал FeO* акцептирует водород от гидроксилируемого участка стероидной молекулы с образованием стероидного радикала и FeOH. Далее образовавшийся стероидный радикал, отнимая гидроксил от геминового железа цитохрома Р-450, превращается в гидроксилированный стероид, а каталитический центр цитохрома Р- 450 готов к приему новых электронов и гидроксилированию следующей молекулы субстрата. Механизм каталитического действия ароматазы, включающий несколько процессов гидроксилирования, идущих по описанной выше схеме, представлен на рис. 5. На схеме отражены пути переноса электронов, протонов и кислорода, а также изменения валентности железа. Данная схема была впервые предложена S. Graham-Lorence и соавт. [18].

Регуляция ароматазной активности

Ароматаза, как и любая другая изоформа цитохрома Р-450, является индуцибельным ферментом [49]. Ее биосинтез на геномном и посттрансляционном уровнях контролируется рядом факторов.

Регуляция активности ароматазы на геномном уровне. Ген ароматазы человека (CYP19) локализован в длинном плече 15-й хромосомы. Он содержит 10 экзонов (I—X), причем только 9 из них (II—X) являются кодирующими [49, 50]. кДНК ароматазы человека содержит 2736 п. н. и кодирует белок с мол. массой 55 кД, состоящий из 503 аминокислотных остатков [34]. Особую роль в изучении молекулярно-генетических механизмов эстрогенообра- зования сыграло доказательство тканевой специфичности регуляции этого процесса, поддерживаемой за счет существования множественных альтернативных промоторов транскрипции гена ароматазы и их селективного использования в отдельных тканях [31, 49, 51, 52]. Так, промотор, активирующий экспрессию ароматазы в плаценте, отстоит на 40 п. н. от сайта инициации транскрипции [53]. Экспрессия гена ароматазы в яичнике человека обеспечивается промотором II, лежащим непосредственно перед сайтом инициации транскрипции и обозначаемым как овариальный. Его особенностью является чувствительность к фолликулостимулирующему гормону (ФСГ) [54, 55]. Промотор II и другой, до сих пор не охарактеризованный промотор активны в жировой ткани, коже и ткани нормальной молочной железы. В данных тканях они не чувствительны к ФСГ и регулируются через посредство цАМФ и глюкокортикоидов, в том числе синтетических (дексаметазон и др.) [56, 57]. Ключ к пониманию механизма сАМР-зависимой активации экспрессии гена ароматазы дает открытие чувствительности промотора II ароматазного гена к CREB (сАМР responsible element binding protein) [58]. Глюкокортикоиды, по всей видимости, индуцируют экспрессию ароматазного гена в виде гормон-рецепторного комплекса, действующего непосредственно как транскрипционный фактор.

В последнее время получены убедительные доказательства в пользу индукции ароматазной активности на геномном уровне при участии стероидогенного фактора (SF-1). Н. Yang и соавт. [59] показали, что промотор II, являющийся предоми- нантным в структуре ароматазного гена, является чувствительным к действию SF-1 в клетках эндо- метриомы человека. Известно также, что в клетках жировой ткани молочной железы на промотор II в составе ароматазного гена воздействует SF-1-подобный фактор, именуемый LRH1 (liver receptor homologue 1). Данный фактор особо активен в проадипоцитах. При дифференцировке последних в зрелые адипоциты уровень экспрессии LRH1 и, соответственно, ароматазы резко снижается благодаря ингибирующему воздействию у-рецептора, активируемого пролифераторами пероксисом (PPAR-y — peroxysome proliferator activated receptor), гиперэкспрессирующегося и аккумулирующегося в условиях вышеупомянутой дифференцировки [60].

Ген ароматазы жировой ткани молочных желез экспрессируется также при участии дистального, цитокинзависимого промотора 1.4 [50]. Некоторые проинфломаторные цитокины, такие как интер- лейкин-lp (IL-lp), интерлейкин-6 (IL-6), фактор некроза опухолей a (TNFa), а также фактор TGF-p (Transforming growth factor p) и фактор роста эпидермиса, индуцируют экспрессию ароматазного гена благодаря опосредованному воздействию именно на этот промотор. С другой стороны, показано, что IL-lp не оказывает какого-либо влияния на активность ароматазы в клетках эндометриомы человека, что свидетельствует о тканевой специфичности чувствительности ароматазного гена к цитокинам [61—64].

Интересна роль простагландинов (PG, в частности PGE2) в индукции экспрессии ароматазы в клетках жировой ткани молочной железы. В работах С. Clyne и некоторых других авторов [65, 66] показано, что PGE2 является мощным активатором экспрессии ароматазного гена в данных клетках. Механизм данного процесса остается неизвестным, но его роль, по всей видимости, занимает одно из центральных мест в активации биосинтеза эстрогенов в жировой ткани молочной железы. Так, установлено, что действие TNFa, который сам по себе способен активировать экспрессию ароматазного гена как цитокин, на клетки жировой ткани молочной железы приводит к активации циклооксигеназы 2 и простагландинсинтазы — ключевых ферментов биосинтеза простагландинов. Исходя из этих данных можно предположить, что PGE2, а возможно и другие простагландины, участвует в цитокинзависимой индукции экспрессии ароматазного гена в жировой ткани молочной железы.

Нами было показано, что полихлорбифенил (ДДТ) и генистеин, как ксеноэстрогены, т. е. регуляторы экспрессии большого количества генов, подавляют экспрессию генов, кодирующих фермент-производитель стероидных эстрогенов — ароматазу [67]. В опытах in vivo установлено, что активность ароматазы в яичниках и матке крыс достоверно снижается под влиянием ДДТ и гени- стеина (изофлавоноид — фитоэстроген). Данные изменения обусловлены снижением количества активного фермента в соответствующих органах. Позже аналогичный эффект был обнаружен для других хлорированных пестицидов с эстрогеноподобным эффектом [68].

Регуляция активности ароматазы на посттрансляционном уровне. Посттрансляционная регуляция ароматазной активности прямо зависит от продукции гема и его включения в структуру апофермента. В данном случае следует прежде всего отметить активность 5-аминолевулинатсинтетазы, катализирующей первую реакцию в гемпродуцирующей цепи и являющейся главным лимитирующим фактором посттрансляционной модификации всех изоформ цитохрома Р-450, в том числе и ароматазы [69].

Следует отметить также роль оксидативного стресса в регуляции ароматазной активности. В частности в ряде работ отмечено ингибирующее влияние оксидативного стресса на содержание изоформ цитохрома Р-450 в микросомах печени и почек. Известно, что в условиях оксидативного стресса, вызванного действием хлорида кобальта, ингибируется биосинтез гема, который необходим для формирования каталитически активных изоформ цитохрома Р-450 [70]. Показано, что кобальтзави- симый оксидативный стресс подавляет активность ароматазы [71]. В данном случае, как и в случаях с АФК-зависимым снижением содержания других изоформ цитохрома Р-450, очевидно, имеет место подавление посттрансляционной модификации апофермента на уровне включения гема в его состав. С другой стороны, ингибирование P-450-за- висимого биосинтеза глюкокортикоидов приводит к торможению активности 5-аминолевулинатсинтетазы, так как именно глюкокортикоиды индуцируют биосинтез данного фермента [72]. Данный процесс в свою очередь приводит к ингибированию биосинтеза гема.

Регуляция активности ароматазы на каталитическом уровне. Фармакологическая коррекция ароматазной активности. Активность ароматазы, как и любого металлопротеина, подвержена различного рода изменениям, связанным с воздействием на каталитический центр (геминовое железо), также существует множество природных и синтетических изостерических ингибиторов данного фермента.

В частности установлено, что восстановители- антиоксиданты, такие как аскорбиновая кислота, глутатион, гидрохинон и цистеин, активируют ароматазу [73]. Как мы уже отмечали выше, в ходе ароматазной реакции НАДФН+Н⁺ отдает электрон и восстанавливает Fe³⁺ в каталитическом центре фермента до Fe²⁺, который взаимодействует с молекулярным кислородом и последовательно гидроксилирует субстрат, используя также оставшийся у НАДФ электрон и два протона [10, 23]. Таким образом, в ходе активации ароматазы восстановители, очевидно, поддерживают железо в структуре ароматазы в восстановленном состоянии, а также, окисляясь, отнимают электроны и протоны у НАДФН+Н⁺ и ускоряют их передачу к каталитическому центру ароматазы на всех этапах катализа.

Особое место в современной биохимии и фармакологии занимает поиск ингибиторов ароматазы, в связи с тем что они дают определенный лечебный эффект при эстрогензависимом канцерогенезе [74—77]. К гормонзависимым злокачественным новообразованиям относят рак молочной железы, эндометрия, яичников, остеосаркому и некоторые другие [78, 79].

В настоящее время открыто и синтезировано множество конкурентных ингибиторов цитохрома Р-450 ароматазы. Благодаря тому что ароматаза обладает низкой структурной гомологией с другими изоформами цитохрома Р-450, участвующими в стероидогенезе, а также катализирует одну из конечных реакций в биосинтезе стероидных гормонов, применение ее селективных ингибиторов не влияет на продукцию других стероидов, таких как глюко- и минералокортикоиды, что делает их использование особенно привлекательным и удобным [80—82].

В зависимости от химической природы ингибиторы ароматазы подразделяют на стероидные и нестероидные [83]. Стероидные ингибиторы составляют 80% от общего количества ингибиторов ароматазы [84, 85]. В настоящее время к используемым в клинике ингибиторам ароматазы относят форме- стан (4-ОН-андростендион), экземестан, атаме- стан и 10-пропаргиландростендион (структурные формулы и ингибиторные константы форместана и экземестана представлены на рис. 6, а) [31]. Данные вещества, называемые также "суицидными «активаторами", являются необратимыми изосте- :-щескими ингибиторами ароматазы. Они необратимо связываются с ее активным центром, полно- 7ъю инактивируя фермент [86], или же действуют субстрат, будучи превращены ферментом в ре- . дивные промежуточные продукты, которые ко- здлентно связываются с активным центром ферента, приводя к полной потере каталитической активности [87, 88]. К недостаткам ингибиторов аанной группы можно отнести многочисленные “ .сочные эффекты, такие как андрогенное дейст- з ;-:е (чрезмерное оволосение, угревая сыпь), прили- ; ы, повышенная потливость, тошнота и др. [31].

Нестероидные ингибиторы ароматазы содержат з своей структуре гетероатом (обычно азот), отли- - аются высокой эффективностью действия и меньшим уровнем привыкания. Данные вещества являйся конкурентными обратимыми ингибиторами ароматазы [89]. По своей орбитальной структуре аанные соединения близки к стероидам и могут □ходить в активный центр ароматазы. При этом механизм ингибирования заключается в связывании с каталитическим центром — геминовым железом, что препятствует гидроксилированию субстрата 90]. К данным' веществам относятся аминоглуте- тимид и подобные ему соединения, а также некоторые производные триазола с хиральной (ворозол, фадразол и др.) и нехиральной (летрозод, анастро- зол и др.) структурой. Структурные формулы, ингибиторные константы и 1С₅₀ данных веществ приведены на рис. 6, б [31]. Недостатком этих ингибиторов как фармпрепаратов является их инородность по отношению к человеческому организму и живым организмам в целом. В силу своей структуры многие из них обладают сродством к некоторым другим ферментам, участвующим в стероидогенезе. Так, например, аминоглутетимид действует на активность многих ферментов, относящихся к суперсемейству цитохрома Р-450 (в частности на активность цитохрома P-450scc и 1 l-p-гидроксилазы или цитохрома P-450XIB1) [91]. Фадразол ингибирует 11-Р-гидроксилазу и 18-а-гидроксилазу (цитохром P-450XVIIIA1), тормозя, таким образом, биосинтез кортизола и альдостерона [91]. С другой стороны, такие селективные ингибиторы ароматазы, как анастрозол, летрозол и другие, являются высокоспецифичными и не влияют на каталитическую активность других ферментов стероидогенеза, однако обладают рядом побочных эффектов, в целом характерных для всех ингибиторов данной группы: тошнота, утомляемость, приливы, головная боль, боль в скелетной мускулатуре и суставах, а также повышенный рвотный рефлекс и затрудненное дыхание [75].

Известные в настоящее время природные ингибиторы ароматазы, например, некоторые сесквитерпены, такие как 8-эпи-8-дезоксикумамбрин В, дегидролейкодин и другие, мало специфичны к ферменту (ингибиторные константы составляют 4 и 21 мкМ соответственно) по сравнению с ингибиторами, применяемыми в фармакологической практике и оказывающими лечебное действие в отношении рака молочной железы [93].

В последнее время установлено, что кверцетин тормозит активность ароматазы в ничтожно малых концентрациях по сравнению с другими природными фармагентами со сходным эффектом — от 18, 75 до 100 нМ [94]. По данным кинетического анализа, ингибирование носит конкурентный характер. Ингибиторная константа составляет 15,6 нМ. Данная величина близка к величинам ингибиторных констант для необратимых конкурентных ингибиторов ароматазы — форместана (10,2 нМ), экземестана (26 нМ) и некоторых других [31]. Из приведенных данных следует, что кверцетин обладает высоким сродством к связывающему сайту активного центра ароматазы. Дальнейшие исследования показали, что ингибирование ароматазы кверцетином носит конкурентный необратимый характер [93, 94]. Данные результаты позволяют рекомендовать кверцетин к исследованиям в качестве фармакологического агента, способного уменьшать активность ароматазы и тормозить биосинтез эстрогенов в организме человека.

Перспективы изучения энзимологии ароматазы и регуляции ее активности

Приведенные в настоящем обзоре данные свидетельствуют о том, что в настоящее время существует значительная база экспериментальных данных по структурной организации, биосинтезу и регуляции активности ароматазы. Исследовано действие поллютантов окружающей среды на ароматазную активность, разработан целый комплекс терапевтических мер, направленных на коррекцию ароматазной активности. Данные о высокоспецифичном и, возможно, необратимом изостерическом ингибировании ароматазы рядом соединений раскрывают новые перспективы в плане поиска природных и неприродных фармакологических агентов, подавляющих ароматазную активность.

Тем не менее ряд важных вопросов, связанных с биохимическими механизмами регуляции активности ароматазы, остается на сегодняшний день открытым. Выяснение данных вопросов необходимо для глубокого понимания процессов стероидогенеза и его регуляции и откроет новые перспективы, связанные с изучением молекулярных механизмов гормонзависимого канцерогенеза.