Взаимодействие селективного агониста прогестерона 16а, 17а-циклогекс-3'-енопрогестерона с рецептором прогестерона матки крысы

Отличительной особенностью биологического действия аналога прогестерона ряда D'-пентаранов — 16а, 17а-циклогекс-3'-енопрогестерона (I), содержащего дополнительное циклогексеновое D’-кольцо, — служит избирательность его эффектов: при системном введении это соединение проявляло более высокую по отношению к действию прогестерона (И) активность в тесте сохранения беременности и сравнительно низкую — в тесте пролиферации эндометрия [1]. Выяснение механизмов возникновения селективности в действии аналогов прогестерона могло бы дать ключ к созданию новых гормонально-активных соединений с заданными медико-биологическими характеристиками. Проведенное в настоящей работе изучение кинетических параметров связывания I с рецептором прогестерона на базе разработанного нами метода синтеза тритированной формы I было предпринято с целью выявления особенностей лиганд-рецепторного взаимодействия, отличающих агонист избирательного действия от природного гормона.

Материалы и методы

В работе использовали синтезированный нами [1, 2-³Н] -16а,    17а-циклогекс-3'-енопрогестерон

([³Н]-1) с удельной радиоактивностью 41 Ки/ммоль и [1, 2, 6, 7-³Н]-прогестерон (³Н-П) фирмы "Amersham" (Англия) с удельной радиоактивностью 84 Ки/ммоль. Чистоту препаратов контролировали тонкослойной хроматографией в системе хлороформ/этиловый эфир 17:3 (объем/объем). Немеченый I синтезирован нами [2], немеченый II получен от фирмы "Sigma" (США). В качестве источника рецептора прогестерона использовали матки крыс смешанной популяции массой 180— 220 г следующих групп: интактных, получавших эстрадиол в дозе 1 мкг в 0,4 мл пропиленгликоля внутримышечно в течение 5 дней, а также животных на 13—14-й или 18—20-й день беременности. Все процедуры проводили при 0—4°С. Ткань матки измельчали и гомогенизировали в 10 мМ трис- НС1- буфере (pH 7,5), содержавшем 10 мМ КС1, 1 мМ дитиотреитола, 0,5 мМ фенилметилсульфо- нилфторида и 30% (объем/объем) глицерина. Соотношение ткань/буфер варьировали от 1:2,5 до 1:8 (масса/объем) в зависимости от ожидаемой концентрации рецептора прогестерона. Гомогенат центрифугировали при 50 000 g 1 ч. При использовании материала от беременных животных для удаления эндогенных гестагенов надосадочную фракцию обрабатывали 30 мин активированным углем (Norit А), покрытым декстраном 70 000 (конечные концентрации 1 и 0,2% соответственно), с последующим осаждением угля центрифугированием [13]. Для определения специфичности сродства лиганд-белкового взаимодействия аликвоты надосадочной фракции (100 мкл) с концентрацией белка 4—12 мг/мл инкубировали с 2— 4- 10³ Бк [³Н]-лиганда в присутствии 3 мкМ гидрокортизона и варьирующих концентраций немеченых лигандов в конечном объеме 200 мкл 5 ч. Несвязанный лиганд удаляли обработкой активированным углем, покрытым декстраном (конечные концентрации 0,67 и 0,13%), в течение 5 мин с последующим центрифугированием. В аликвотах надосадочной фракции измеряли содержание радиоактивности на жидкостном сцинтилляционном спектрометре "Rackbeta 1217" с эффективностью счета 30%. Количество специфически связанного [³Н]-лиганда оценивали по разнице между величинами связанной радиоактивности, измеренными в отсутствие (суммарное связывание) и в присутствии избытка (3 мкМ) немеченого стероида (неспецифическое связывание). Относительную конкурентную активность определяли методом S. Когешпап [12], характер ингибирования связывания и равновесную константу диссоциации оценивали в двойных обратных координатах [10], константу ингибирования измеряли в производных координатах наклон—концентрация [9]. Для изучения кинетики диссоциации [³Н]-ли- ганд-белковых комплексов надосадочную фракцию гомогената инкубировали с [³Н]-стероидом 1 ч, добавляли избыток (3 мкМ) немеченого лиганда и измеряли количество специфически связанной радиоактивности через 20—300 мин обработкой проб активированным углем. Анализ результатов проводили методом В. Weichman и A. Notides [14]. Влияние лиганда на стабильность рецептора изучали по динамике уровня специфического связывания [³Н]-стероидов. Тестирование изменений связывающей активности рецептора в отсутствие лиганда проводили с помощью инкубации в течение 1 ч с [³Н]-П. Концентрацию белка определяли окраской кумасси [8]. Все операции проводили в кварцевых пробирках, покрытых 3% альбумином, для подавления гидрофобной адсорбции I [4].

Результаты и их обсуждение

[³Н]-16а, 17а-циклогекс-3'-енопрогестерон специфически (т. е. с высоким сродством и ограниченной емкостью) связывается белком растворимой фракции матки крысы. Величина K_d взаимодействия I с белком (см. таблицу) лишь ненамного превышает аналогичный параметр природного гормона. Линейный характер изотермы связывания (рис. 1) свидетельствует об однородности связывающих участков белка по сродству к I.

Кинетические параметры взаимодействия прогестерона (II) и 16а, 17а-циклогекс-3 ’-енопрогестерона (I) с белком растворимой фракции матки крысы

Меченый лиганд

С^-1 • 10⁵

[³Н]-прогестерон

[³Н]-16а, 17а- циклогекс-3’- енопрогестерон

0,33 ± 0,04 15 (2)        -        6,9 ± 2,6 1,8 (2)

• (3)

0,89 ± 0,35       -       8,5 (2) 11,6 ± 2,0 1,7 (2)

• (4)

Примечание. В скобках — число определений. * — за 1 принята активность прогестерона.

Немеченый II способен полностью вытеснять [³Н]-1 из специфических комплексов с белком, и это ингибирование носит конкурентный характер, о чем свидетельствует пересечение изотерм в точке на оси ординат, соответствующей величине 1/В_тах (см. рис. 1). Эффективность, с которой II вытесняет [³Н]-1 из комплексов с белком, оцениваемая по величинам К_; и относительной конкурентной активности (см. таблицу), соответствует величине

Рис. 1. Анализ ингибирования связывания [³Н]-16а, 17а-цик- логекс-З'-енопрогестерона прогестероном (а) и связывания [³Н]-прогестерона 16а, 17а-циклогекс-3'-енопрогестероном (б) в растворимой фракции матки эстрогенизированных и беременных крыс соответственно. 1 — в отсутствие конкурента, 2 и 3 — в присутствии 7 и 14 нМ конкурента. B_s — специфически связанный [³Н]-лиганд; U — несвязанный лиганд. Конечная концентрация белка 2,8 мг/мл (а) и 5,1 мг/мл (б).

IQ связывания белком самого [³Н]-П. Эти результаты позволяют сделать заключение о том, что I связывается белком, идентичным рецептору прогестерона, и что других специфических, участков связывания I в растворимой фракции матки крысы нет. Данный вывод подтверждается анализом ингирования I связывания [³Н]-Н (см. таблицу, рис. 1): при таком варианте экспериментов результаты симметричны описанным выше.

Хроматографический анализ радиоактивного материала, выделенного после инкубации [³Н]-1 и [³Н]-П с растворимой фракцией матки, показал отсутствие метаболических превращений [³Н] -лигандов. Существенных различий в характере взаимодействия [³Н]-1 и [³Н]-П с рецептором, полученным от животных разных групп, не обнаружено.

Анализ кинетики диссоциации специфических комплексов [³Н]-1 с белком (рис. 2) свидетельствует о двухфазности процесса. Учитывая линейный характер равновесных изотерм связывания I (см. выше), следует предположить, что кинетика процесса ассоциации I с белком также носит двухфазный характер. Двухфазный тип кинетики диссоциации наблюдается и в случае комплексов белка с [³Н]-П (см. рис. 2). Величины константы скорости диссоциации для медленной фазы (kJ',) процесса распада комплексов I и II с рецептором близки между собой (см. таблицу). Надежное измерение величины k2j для быстрой фазы диссоциации комплексов I с белком при данной постановке экспериментов затруднено, но приблизительная оценка дает величину, близкую к аналогичному параметру для II (= 5 • 10^-4 С^-1). Вместе с тем в кинетике диссоциации комплексов I и II имеется существенное различие, касающееся доли быстродиссоциирующих комплексов: в случае I

Рис. 2. Кинетика диссоциации комплексов [³Н]-прогестеро- на (/) и [³Н]-16а, 17а-циклогекс-3'-енопрогестерона (2) с белком растворимой фракции матки интактных крыс. В_о — исходное; B_t — текущее значение количества специфически связанного [³Н]-лиганда. /"и 2" — результат вычитания бы- стродиссоциирующего компонента. Конечная концентрация белка 2,7 мг/мл.

Рис. 3. Динамика уровня специфического связывания [³Н]- прогестерона (7) и [³Н]-16а, 17а-циклогекс-3'-енопрогестеро- на (2) белком растворимой фракции матки интактных крыс. 3 — прогестеронсвязывающая активность неоккупированно- го лигандом белка. Представлены средние величины 2 экспериментов. Конечная концентрация белка 3,1 и 2,2 мг/мл.

вклад этих комплексов в суммарное связывание составлял около 30%, а в случае II — более 90%.

Различия в свойствах комплексов I и II с белком обнаружены также при анализе динамики изменений в уровне специфического связывания [³Н]-1 и [³Н]-П в ходе инкубации с растворимой фракцией матки (рис. 3). Максимальный уровень специфического связывания в обоих случаях наблюдался через 5 ч инкубации, но при использовании [³Н]-1 последующее уменьшение связывания было существенно более глубоким, чем при использовании [³Н]-П, и соответствовало снижению связывающей активности рецептора прогестерона в отсутствие лиганда.

Использование тритированной формы I для анализа взаимодействия этого аналога прогестерона с белками растворимой фракции матки крысы позволило отчасти снять неопределенность в вопросе об особенностях проведения сигнала I. Очевидно, что классический рецептор прогестерона может быть посредником действия I на матку и что другого, специального рецептора для I в растворимой фракции матки нет. Не исключено, что "ножницы” между различными типами биологической активности I [1] обусловлены разной представленностью основных путей действия гестагенов (геномного и негеномного) в разных тканях. Установлено, что гормональная специфичность экстрануклеарного пути действия гестагенов существенно отличается от таковой классического ядерного рецептора [6, 7]. Более того, ранее было обнаружено, что I не конкурирует с [³Н]-П за связывающие участки плазматической мембраны матки крысы [3]. Вместе с тем полученные нами результаты о различиях в свойствах комплексов I и II с рецептором прогестерона (соотношение быстро- и медленно диссоциирующих комплексов, степень защиты рецептора от деградации) могут отражать различия в конформации соответствующих лиганд-рецепторных комплексов. Вероятно, эти особенности сопряжены с избирательностью действия I. В структуре молекул ядерных рецепторов стероидных гормонов обнаружены по меньшей мере 2 дискретные активационные функции, дифференциально реализуемые в контексте разных компетентных генов и тканей и в разной мере индуцируемые полными и частичными агонистами и антагонистами [5, 11].

Работа выполнена при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (код проекта 96-03-32780).

Выводы

1. Селективный аналог прогестерона 16а, 17а-циклогекс-3'-енопрогестерон специфически взаимодействует с рецептором прогестерона, но не с другими белками растворимой фракции матки крысы.
2. Сродство 16а, 17а-циклогекс-3'-енопрогесте- рона к рецептору прогестерона (K_d =11,6 нМ) несколько ниже сродства прогестерона (К_с1 = 6,9 нМ); прочность комплексов аналога с рецептором (к;*! = 1,8- 10~⁵ С^-1, к:₁ = 4,5-10^-4 С^-1) сходна с таковой для прогестерона.
3. Конформация рецептора прогестерона в комплексе с 16а, 17а-циклогекс-3'-енопрогесте- роном отличается от конформации рецептора в комплексе с прогестероном, что отражается в меньшем соотношении быстро- и медленно диссоциирующих лиганд-рецепторных комплексов в случае аналога и в меньшей способности аналога защищать рецептор от деградации.