Preview

Проблемы Эндокринологии

Расширенный поиск

Фрагмент аполипопротеина B с инсулиноподобной иммунореактивностью

https://doi.org/10.14341/probl11400

Содержание

Перейти к:

Аннотация

Целью данного исследования являлось иммунохимическое изучение фрагмента аполипопротеина В, обладающего инсулиноподобной иммунореактивностью. В статье его име­новали как "пептид В". Пептид, выделенный методом элек­трофоретического элюирования, был использован для полу­чения специфических антител. Антитела к пептиду В реа­гировали с аполипопротеином В-100, цельной сывороткой, сывороткой после осаждения β-липопротеинов и с суперна­тантом, полученным после удаления всех липопротеинов путем ультрацентрифугирования. Был оптимизирован ме­тод ИФА для определения пептида В в сыворотке крови по­сле осаждения β-липопротеинов. По сравнению со здоровы­ми донорами содержание пептида В в сыворотке крови больных СД типа 2 было достоверно выше. С увеличением индекса массы тела и длительности заболевания содержание пептида В возрастало.

Для цитирования:


Панин Л.Е., Потеряева О.Н., Воронова О.С., Шевкопляс О.П., Поляков Л.М. Фрагмент аполипопротеина B с инсулиноподобной иммунореактивностью. Проблемы Эндокринологии. 2002;48(1):6-9. https://doi.org/10.14341/probl11400

For citation:


Panin L.Ye., Poteryaeva O.N., Voronova O.S., Shevkoplyas O.P., Polyakov L.M. A fragment of apolipoprotein B with insulin-like immunoreactivity. Problems of Endocrinology. 2002;48(1):6-9. (In Russ.) https://doi.org/10.14341/probl11400

Подавляющее большинство больных сахарным диабетом - СД (около 85%) страдают СД типа 2. В настоящее время полагают, что в патогенезе СД типа 2 основную роль играет не нарушение образования инсулина, а нарушение контроля инсулиновой секреции при действии естественных стимуляторов освобождения гормона [1]. Некоторые инсулиннезависимые формы диабета прямо связаны с преобладанием в крови веществ с контринсулярным эффектом [6]. Многие из этих веществ до сих пор не идентифицированы, и природа их остается неизвестной. Недавно нами было показано, что атерогенные фракции липопротеинов (ЛП) плазмы крови дают контринсулярный эффект, связанный со снижением поглощения глюкозы периферическими тканями, в первую очередь мышцами [3]. Показано, что ЛП низкой (ЛПНП) и очень низкой (ЛПОНП) плотности могут снижать продукцию инсулина р-клетками островков Лангерганса поджелудочной железы [2|. Носителем контринсуляр- ного эффекта оказался апопротеин В (апоВ), входящий в состав ЛПНП и ЛПОНП. Целью данного исследования являлось изучение фрагмента аполипопротеина В, обладающего инсулиноподобной иммунореактивностью, поскольку ранее было показано, что он является продуктом лимитированного протеолиза апоВ [2, 3]. Материалы и методы В контрольную группу вошли 17 человек в возрасте 40-61 года с показателями углеводного и липидного обменов в пределах возрастной нормы. Больные СД типа 2 находились на лечении в клинике Научного центра клинической и экспериментальной медицины: всего обследовано 40 человек в возрасте 45-71 года (средний возраст 54,9 ± 5,4 года), из них 16 женщин и 24 мужчины. Относительную массу тела оценивали по индексу Кетле, который рассчитывали по формуле: масса тела (в кг)/рост (в м)2. Ранее методами иммунохимического анализа было выявлено присутствие общих антигенных детерминант в молекулах апоВ-100 и инсулина [2]. После этого был выбран один из пептидов (продуктов лимитированного протеолиза апоВ), обладающий инсулиноподобной иммунореактивностыо. Мы обозначили его как "пептид В". Инсулиноподобная иммунореактивность была идентифицирована при электрофорезе апоВ в ПААГ с последующим иммуноблоттингом с антителами к инсулину [2, 3). В нашей работе неокрашенные участки геля, содержащие исследуемый пептид, измельчали в гомогенизаторе в 0,15 М NaCI и использовали для иммунизации животных. С целью получения специфических поликлональных антител кроликов иммунизировали по схеме, описанной нами ранее [5]. Пептид В, выделенный методом электрофоретического элюирования, использовали также в дальнейшей работе при проведении твердофазного иммуноферментного анализа (тИФА). Концентрацию белка определяли по Лоури, используя бычий сывороточный альбумин в качестве стандарта [10]. Иммуноглобулины из сыворотки крови выделяли осаждением с помощью сульфата аммония. Осадок отделяли центрифугированием. Операцию повторяли 3-4 раза. Полученный препарат диализовали против 0,01 М фосфатного буфера pH 7,4. Заключительную очистку IgG проводили с помощью хроматографии на анионообменнике DEAE-Toyopearl 650 M"TSK" (Япония). Для идентификации антител к пептиду В использовали реакцию двойной радиальной иммунодиффузии по Оухтерлони [11]. Для тИФА использовали аполипопротеины В- 100 и В-48. С этой целью ЛПОНП и ЛПНП выделяли методом препаративного ультрацентрифугирования [8] в растворах КВг на центрифуге "Beckman L5-75" (США). Дел и лидирование проводили охлажденной смесыо хлороформ-метанол (1:1) с последующей многократной отмывкой эфиром. Аполипопротеины разделяли методом гель-фильтрации на Сефарозе CL-6B |5]. Чистоту аполипопротеинов исследовали методом диск-электрофореза [9]. Для получения сыворотки крови, не содержащей ЛП, последние удаляли методом ультрацентрифугирования, а также путем осаждения ЛПОНП и ЛПНП гепарином в присутствии СаС12 по Бурштейну [7]. Иммуноферментный анализ на твердой фазе проводили в полистироловых планшетах "Nunk" (Дания). Пептид В в 0,01 М фосфатно-солевом буфере (ФСБ) pH 7,4 в концентрации 10 мкг/мл наносили на планшет по 100 мкл в лунку и инк^ировали при 4°С в течение ночи. После инкубации планшеты трижды отмывали 0,01 М ФСБ, содержащим 0,05% твин-20 (ФСБТ). Незанятые места сорбции блокировали 10% нормальной лошадиной сывороткой, содержащей 0,05% раствор лактальбумина. В подготовленные таким образом планшеты добавляли по 100 мкл специфических антител при последовательном двукратном разведении ФСБТ, начиная с разведения 1:100. Продолжительность инкубации антител с пептидом В составляла 1 ч при 37°С. Избыток антител удаляли троекратным промыванием ФСБТ. Для насыщения связавшихся антител использовали козьи антитела к IgG кролика (вторые антитела), меченные пероксидазой хрена ("Sigma", США). По 100 мкл раствора вторых антител добавляли в каждую ячейку в разведении 1:1000. Планшеты инкубировали 1 ч при 37°С. После 5-кратного промывания ФСБТ проводили ферментативную реакцию. Для этого в ячейки вносили по 200 мкл свежеприготовленного субстрата - ортофенилендиамина ("Merk", ФРГ) в концентрации 20 мг на 100 мл 0,1 М фосфат-цитратного буфера pH 5,0, содержащего 0,006% раствора перекиси водорода. Через 15 мин ферментативную реакцию останавливали добавлением 50 мкл 1Н H2SO4. В качестве контрольных использовали ячейки, в которых вместо антигена добавляли по 100 мкл ФСБ. Результаты и их обсуждение Полученные кроличьи антитела к пептиду В были охарактеризованы с помощью двойной радиальной иммунодиффузии. На рис. 1 видно, что антитела давали одну полосу преципитации с пептидом В (7-4, титр 1:32). С ЛПОНП, ЛПНП и сывороткой крови антитела не реагировали, вероятно, в связи с тем, что метод Оухтерлони позволяет выявлять достаточно большие количества антигена. Кроме того, соответствующие антигенные детерминанты в ЛПОНП и ЛПНП могут быть экранированы липидной фазой. В дальнейшем изучение антител к пептиду В проводили с помощью непрямого тИФА, который отличается высокой по сравнению с двойной ради-алычой иммунодиффузией разрешающей способностью (до 50 пг). Для установления оптимального разведения антител на планшеты сорбировали избыточное количество пептида В (1 мкг/100 мкл в ФСБ). Образцы антител раститровывали при последовательном двукратном разведении буфером, содержащим 0,05% твин-20. Далее методику проводили по схеме (см. раздел "Материалы и методы"). Конечный титр антител составил 1:20 000. На рис. 2 представлена кривая титрования антител к пептиду В. В наших условиях было найдено оптимальное разведение антител - 1:1000. Для установления рабочего режима метода планшеты инкубировали с растворами различных антигенов (пептид В, апоВ-100 и апо В-48) в концентрации 1, 2, 5, 10, 20, 50 и 100 нг/100 мкл в ФСБ. Вид калибровочной кривой зависел от выбранного антигена (рис. 3). Интенсивность ферментативной реакции в случае с апоВ-48 значительно уступала значениям оптической плотности при использовании в качестве антигенов пептида В и апоВ-100, калибровочные кривые которых были сходными. Кривые титрования цельной человеческой сыворотки, сыворотки после осаждения суммарной фракции ЛПОНП и ЛПНП по Бурштейну, а также сыворотки, лишенной всех ЛП в процессе ультрацентрифугирования, представлены на рис. 4. В связи с тем что цельная сыворотка содержала большое количество антигенных детерминант для исследуемых антител, в последней точке калибровочного графика (разведение 1:100 000) значение экстинции было достаточно высоким. Для получения графика стандартной формы требовалось еще большее разведение сыворотки, что, несомненно, приводило бы к потере достоверности результатов. Калибровочные кривые сыворотки без суммарной фракции ЛПОНП и ЛПНП, а также сыворотки, лишенной всех Л П, повторяли друг друга и имели более привычный вид. Таким образом, было решено в дальнейшем использовать для исследований сыворотку, лишенную суммарной фракции апоВ-содержащих ЛП (осаждение по Бурштейну), по причине простоты получения данного материала. Рабочее разведение материала составило 1:8000. При исследовании сыворотки крови на содержание пептида В оказалось, что его содержание в сыворотке больных СД типа 2 было достоверно выше по сравнению с таковым у здоровых доноров. Среднее значение в контрольной группе составило 1,83 ± 0,32 ммоль/л, а у больных СД типа 2 - 2,26 ± 0,35 ммоль/л (р < 0,05). С увеличением индекса массы тела содержание пептида В в сыворотке крови еще немного возрастало (2,33 ± 0,22 ммоль/л; р < 0,05). При длительности заболевания более 6 лет содержание пептида В увеличивалось, особенно у женщин (2,47 ± 0,42 ммоль/л; р < 0,01 по сравнению с контрольной группой). Ранее нами было показано, что наличие перекрестной иммунореактивности между инсулином и аполипопротеином В обусловлено наличием в структуре обоих соединений общего эпитопа. В инсулине он располагается в рецепторно-значимой области |4|. В аполипопротеине В он находится в N- терминальном конце, однако точная локализация его не установлена. Именно их общий эпитоп определяет наличие конкурентных взаимоотношений между инсулином и аполипопротеином В в борьбе за инсулиновый рецептор. Пептид В - это фрагмент аполипопротеина В, содержащий данный эпитоп. Мы предполагаем, что выделенный нами пептид В и апоВ-содержащие ЛП, обладающие инсулинопо- Рис. 4. Кривые титрования цельной сыворотки, сыворотки после осаждения суммарной фракции ЛПНП и ЛПОНП. сыворотки без ЛП антителами к пептиду В. / - цельная сыворотка; 2 - сыворотка после осаждения ЛПОНП и ЛПНП; 3 - сыворотка после удаления всех ЛП путем ультрацентрифугирования. По оси абсцисс - разведения сыворотки. добной иммунореактивностыо и контринсулярным эффектом, являются одной из возможных причин развития СД типа 2. Кроме того, обладая способностью снижать продукцию инсулина р-клетками островков Лангерганса, апоВ-содержащие ЛП усугубляют течение инсулинзависимого диабета [2]. Выводы 1. Получены специфические антитела к фрагменту аполипопротеина В (пептид В), обладающему инсулиноподобной иммунореактивностью. 2. Антитела к пептиду В в ИФА реагировали с аполипопротеином В-100, цельной сывороткой, сывороткой после осаждения суммарной фракции - ЛПНП и ЛПОНП и с сывороткой после удаления всех Л П путем ультрацентрифугирования. 3. По сравнению со здоровыми донорами содержание пептида В в сыворотке крови больных СД типа 2 было достоверно выше. С увеличением длительности заболевания содержание пептида В возрастало.

Список литературы

1. Дедов И. И., Фадеев В. В Введение в диабетологию. - М., 1998.

2. Пакин Л. Е., Останина Л. С., Атучина Н. В. // Бюл. экс- пер. биол. - 1994. - № 9. - С. 258-261.

3. Панин Л. Е., Останина Л. С., Колпаков А. Р. // Вопр. мед. химии. - 1995. - Т. 41, № 6. - С. 12-16.

4. Панин Л. Е., Сабиров А. И., Максютов А. 3. и др. // Молекул. биол. - 1997. - Т. 31, № 2. - С. 366-372.

5. Поляков Л. М., Потеряева О. Н., Панин Л. Е. // Лаб. дело. 1991. - № 9. - С. 24-26.

6. Рендел А. Диабет / Под ред. Р. Уильямс. - М., 1964.

7. Burstein М., Samaille J. // Clin. Chim. Acta. - 1960. - Vol. 71, N 5. - P. 609-615.

8. Hatch F. T., Lees R. S. // Adv. Lipid Res. - 1968. - Vol. 6. P. 2-11.

9. Laemmli U. K. // Nature. - 1970. - Vol. 227. - P. 680-685.

10. Lowry О. H., Rosebrough N. J., Farr A. L., Randal R. J. // J. Biol. Client. - 1951. - Vol. 193. - P. 265-275.

11. Ouchterlony 0.11 Progr. Allergy. - 1958. - Vol. 5. - P. 1-77.


Об авторах

Л. Е. Панин

Институт биохимии Сибирского отделения Российской академии медицинских наук


Россия


О. Н. Потеряева

Институт биохимии Сибирского отделения Российской академии медицинских наук


Россия


О. С. Воронова

Институт биохимии Сибирского отделения Российской академии медицинских наук


Россия


О. П. Шевкопляс

Институт биохимии Сибирского отделения Российской академии медицинских наук


Россия


Л. М. Поляков

Институт биохимии Сибирского отделения Российской академии медицинских наук


Россия


Рецензия

Для цитирования:


Панин Л.Е., Потеряева О.Н., Воронова О.С., Шевкопляс О.П., Поляков Л.М. Фрагмент аполипопротеина B с инсулиноподобной иммунореактивностью. Проблемы Эндокринологии. 2002;48(1):6-9. https://doi.org/10.14341/probl11400

For citation:


Panin L.Ye., Poteryaeva O.N., Voronova O.S., Shevkoplyas O.P., Polyakov L.M. A fragment of apolipoprotein B with insulin-like immunoreactivity. Problems of Endocrinology. 2002;48(1):6-9. (In Russ.) https://doi.org/10.14341/probl11400

Просмотров: 242


ISSN 0375-9660 (Print)
ISSN 2308-1430 (Online)