Продукция некоторых цитокинов у больных с аутоиммунными заболеваниями щитовидной железы

Соотношение провоспалительных и противо­воспалительных цитокинов играет важную роль в поддержании иммунного гомеостаза; их дисбаланс вносит значительный вклад в патогенез аутоим­мунных заболеваний, в том числе щитовидной же­лезы [1, 3, 10]. Провоспалительные цитокины, та­кие как фактор некроза опухолей а (ФНОа), ин­терлейкины (ИЛ) 1 и 6 активируют пролиферацию В- и Т-лимфоцитов, повышают экспрессию рецеп­тора ИЛ-2 на цитотоксических лимфоцитах, про­дукцию ИЛ-2 Т-клетками и иммуноглобулинов В- клетками [5]. Кроме того, ИЛ-1р является единст­венным цитокином, способным индуцировать на клетках щитовидной железы экспрессию рецепто­ра апоптоза, или Fas-антигена [17], что является еще одним свидетельством роли данного цитокина в развитии аутоиммунных реакций, а ФНОа, гомо­лог Fas-лиганда, является наиболее апоптогенным из цитокинов [6]. ИЛ-10 относится к числу проти­вовоспалительных цитокинов, его продуцентами могут быть моноциты, макрофаги и активирован­ные Т-хелперы. Этот цитокин способен ингибиро­вать продукцию провоспалительных цитокинов ИЛ-1, ИЛ-6, ФНОа разными клетками [5], влияя на развитие аутоиммунного процесса.

Вопрос о преобладании цитокинов, продуци­руемых тем или иным классом Т-хелперов (Тх), в развитии аутоиммунных заболеваний щитовидной железы до конца неясен. Существует мнение о том, что ключевую роль в их инициировании играет продукт Тх типа 1 (Тх1) у-интерферон, участвуя в регуляции продукции аутоантител [18], ингибируя транскрипцию гена тиреоглобулина (ТГ) [14] и мо­дулируя функционирование и пролиферацию фол­ликулярных клеток щитовидной железы [9]. С дру­гой стороны, учитывая усиление продукции анти­тел при аутоиммунных заболеваниях, следовало бы ожидать, что преобладающей будет популяция Тх типа 2 (Тх2), что и отмечается в ряде исследований [12, 21]. Таким образом, в литературе встречаются данные, свидетельствующие о сдвигах в сторону как Тх1, так и Тх2, причем они могут не противо­речить друг другу, так как получены на разных ста­диях патологического процесса.

Целью нашего исследования было выявление особенностей цитокинового звена при таких ауто­иммунных заболеваниях щитовидной железы, как диффузный токсический зоб (ДТЗ) и аутоиммун­ный тиреоидит (АИТ).

Материалы и методы

Обследовано 20 пациентов с ДТЗ в состоянии эутиреоза, длительность заболевания у которых ко­лебалась от 1 года до 3 лет и в среднем составила 2,1 ± 0,5 года. Женщины составили 73,7% изучен­ной группы, мужчины — 26,3%. Также обследовано 18 больных АИТ, подвергшихся оперативному ле­чению в сроки от 1 года до 6 лет до момента иссле­дования. Средняя длительность заболевания в этой группе составила 7,0 ± 1,0 года (колебания от 2 до 14 лет), все больные были женского пола. Показа­ниями к оперативному вмешательству по поводу АИТ служили значительное (III или IV степени) увеличение щитовидной железы, приводящее к ощущению удушья, узловая трансформация щито­видной железы на фоне АИТ, подозрение на зло­качественную трансформацию, а также диагности­ческие ошибки, когда псевдоузлы принимали за уз­лы. Объем резекции при АИТ обусловливался по­казаниями, объем оперативного вмешательства при ДТЗ — субтотальная резекция с оставлением 6—12 г у верхних полюсов. Все диагнозы АИТ и ДТЗ верифицированы гистологически. Контроль­ную группу составили 25 доноров крови Россий­ского НИИ гематологии и трансфузиологии (Санкт- Петербург).

В ходе исследования изучали способность моно- нуклеарных клеток периферической крови к спон­танной и индуцированной продукции ФНОа, ИЛ- 1р и ИЛ-6; уровень ИЛ-10 в сыворотке крови; со­держание аутоантител к ТГ (АтТГ) в сыворотке крови. Мононуклеарные клетки периферической крови выделяли в стерильных условиях на гради­енте плотности Lymphoprep ("Sigma"), трижды от­мывали и культивировали в течение 24 ч при 37°С и 5% СО₂ в 96-луночных планшетах в количестве 2 • 10⁵ на лунку. Для культивирования использова­ли среду RPMI ("Биолот", Санкт-Петербург) с до­бавлением 10% эмбриональной телячьей сыворот­ки ("Биолот", Санкт-Петербург) и 80 мкг/мл гента­мицина. Мононуклеары культивировали как в при­сутствии индуктора (стимулированная продукция), так и без него (спонтанная продукция). Определя­ли также индекс стимуляции, вычислявшийся пу­тем деления величины стимулированной продук­ции на величину спонтанной продукции для каж­дого из цитокинов и измерявшийся в абсолютных единицах. В качестве индуктора синтеза ФНОа и ИЛ-lp использовали раствор пирогенала как ис­точник липополисахарида в дозе 0,1 мкг на лунку. В качестве индуктора синтеза ИЛ-6 применяли фи­тогемагглютинин в дозе 10 мкг на лунку. Все пробы ставили в триплетах. Собранные после завершения культивирования супернатанты собирали и иссле­довали на наличие цитокинов методом иммуно- ферментного анализа. При определении продук­ции ФНОа, ИЛ-lp и ИЛ-6 использовали тест-сис­темы фирмы "Протеиновый контур" (Санкт-Пе­тербург), при определении уровня ИЛ-10 — тест- системы фирмы "R&D Systems" (США).

Содержание АтТГ в сыворотке крови боль­ных определяли стандартным методом иммуно- ферментного анализа с помощью тест-системы 'ТММСО-Diagnostics" (США). Интенсивность ок­раски, пропорциональную концентрации антител (в МЕ/мл), регистрировали с помощью автомати­ческого многоканального спектрофотометра ("Or­ganon Teknika") при длине волны 405 нм.

Для статистической обработки использовали t- тест Стьюдента. Значения приведены в виде М ± т, где т — стандартная ошибка средней.

Результаты и их обсуждение

Из представленных в табл. 1 данных следует, что при АИТ спонтанная продукция ФНОа перифери­ческими мононуклеарными клетками оказалась зна­чительно выше нормальных значений (р < 0,001), тогда как при ДТЗ ее повышение было статистиче­ски не значимо. В то же время способность к ин­дуцированной продукции данного цитокина в обе­их группах больных была близка к норме. Подтвер­ждением повышенной способности мононуклеар- ных клеток больных с тиреоидной патологией к синтезу ФНОа является, по-видимому, и обнару­живаемый некоторыми авторами его высокий уро­вень в крови пациентов с ДТЗ [2]. Способность клеток спонтанно продуцировать ИЛ-lp была по­вышена по сравнению с нормой в обеих группах больных (см. табл. 1), причем опять же это повы­шение наиболее выражено при АИТ (в 19,7 раза (р < 0,01) и 8,9 раза (р < 0,05) в группах пациентов с АИТ и ДТЗ соответственно). Индуцированная продукция данного цитокина в отличие от ФНОа оказалась повышена как при ДТЗ (в 1,6 раза; р < 0,05), так и при АИТ (в 2 раза; р < 0,05). В то же время различия в способности отвечать усилением продукции цитокина на стимул, определяемой по индексам стимуляции, носят сходный характер для ФНОа и ИЛ-1р. Так, индексы стимуляции продук­ции ФНОа в группе больных ДТЗ были снижены в 4 раза, а при АИТ — в 7,8 раза, составляя 13,1 ± 3,5 и 6,9 ± 1,3 соответственно при норме 53,7 ± 12,1. Индексы стимуляции продукции ИЛ-lp были сни-

Таблица 1

Продукция ФНОа и ИЛ-10 мононуклеарными клетками периферической крови у больных АИТ и ДТЗ (М ± т)

При ме ча ние. Здесь и в табл. 2: достоверность различий с группой доноров: * — р < 0,05; ** — р < 0,01; *** — р < 0,001.

Таблица 2

Продукция ИЛ-6 клетками периферической крови и содержание ИЛ-10 в сыворотке у больных АИТ и ДТЗ (М ± т)

Группа обследованных

Больные АИТ

Больные ДТЗ Доноры

Спонтанная про­дукция ИЛ-6, пг/мл

857,1 ± 204,2**

342,9 ± 156,1**

51,0 ± 15,5

Индуцирован­ная продукция ИЛ-6, пг/мл

Сывороточная продукция ИЛ-10, пг/мл

1061,7 ± 99,6

1000 ± 72,3

1063,6 ± 68,7

179,8 ± 30,2**

175,5 ± 30,2**

7,8 ± 2,2

жены при ДТЗ в 1,8 раза, а при АИТ в 4,3 раза, со­ставив 19,9 ± 4,9 и 8,3 ±1,2 соответственно при норме 35,5 ± 5,7.

Известно, что провоспалительные цитокины ФНОа и ИЛ-10 играют важную роль в развитии ау­тоиммунных заболеваний щитовидной железы. Так, наряду с у-интерфероном они участвуют в ре­гуляции продукции аутоантител [18], стимулируют пролиферацию антигенспецифических Т- и В- лимфоцитов, образующих клоны к различным ан­тигенным эпитопам, а также стимулируют синтез гликозаминогликанов в ретроорбитальных фиб­робластах и модулируют экспрессию на них рецеп­тора к ТТГ [15, 19], способствуя развитию офталь­мопатии при ДТЗ. ФНОа и ИЛ-10 обладают спо­собностью усиливать и(или) вызывать аберрант­ную экспрессию молекул адгезии и антигенов гис­тосовместимости (HLA) II класса на поверхности тироцитов [7], что может приводить к нарушению процессов антигенного распознавания и запуску аутоиммунных процессов в щитовидной железе.

Как показано в табл. 2, при обоих заболеваниях отмечается значительное усиление способности периферических иммунокомпетентных клеток к спонтанной продукции ИЛ-6 по сравнению со здо­ровыми лицами, наиболее выраженное при АИТ. Способность к стимулированной продукции дан­ного цитокина по абсолютным значениям оказа­лась близка к нормальной, тогда как вследствие уже имеющейся клеточной активации индексы стимуляции были значительно снижены: в 1,7 раза при ДТЗ (29,6 ±11,6 при норме 50,1 ± 20,7) и в 6 раз при АИТ (8,0 ± 3,9). Кроме того, как при ДТЗ, так и при АИТ был значительно повышен уровень ИЛ-10 в сыворотке крови (см. табл. 2). Оба этих цитокина, как известно, являются продуктами Тх2.

Сдвиг в сторону Тх2, по крайней мере при ДТЗ, показан и другими исследователями [13], подтвер­дившими, таким образом, ключевую роль анти- ТТГ-антител и гуморального иммунитета в патоге­незе данного заболевания. ИЛ-10, как известно, является важным цитокином для стимуляции про­дукции аутоантител и одновременно может играть роль в подавлении клеточно-опосредованного по­вреждения щитовидной железы, выполняя протек- тивную роль в отношении аутодеструкции ее ткани [8, 22]. Т-зависимая активация В-клеток через мо­лекулу CD40 является триггером избыточной про­дукции ИЛ-10 и сдвига в сторону активности Тх2 у пациентов с ДТЗ [11].

Наряду со всем вышеизложенным существует мнение [16, 20] о том, что при аутоиммунных за­болеваниях щитовидной железы отсутствует выра­женный сдвиг в сторону Тх1 или Тх2, и цитокины, присущие обоим типам Тх, могут продуцироваться инфильтрирующими ткань Т-клетками одновре­менно. Таким образом, различия между аутоим­мунными заболеваниями щитовидной железы мо­гут быть эффектом функционально доминирую­щей в данный момент популяции Тх. Эта хрониче­ски активируемая in vivo антигенспецифическая популяция, локально продуцирующая цитокины профиля Тх1 или Тх2, может быть ответственной за развитие того или иного вида патологии щитовид­ной железы.

Учитывая сказанное выше о роли ИЛ-10 в сти­муляции антителообразования, мы сравнили уров­ни сывороточных АтТГ в группах больных ДТЗ и АИТ. ТГ — белок-предшественник гормонов щи­товидной железы — является одним из ее основных аутоантигенов [4]. Он представляет собой йодиро­ванный гликопротеид, молекул которого имеет 50 антигенных детерминант, но только 4 из них могут быть аутоантигенными, что связано с особенностя­ми вторичной и третичной структуры молекулы ТГ. Ограниченное число аутоантигенных областей на его молекуле приводит к низкой комплементсвя- зывающей активности образованных ими иммун­ных комплексов.

В зависимости от уровня аутоантител больные были разделены на 4 группы (табл. 3). В 1-ю вошли пациенты, уровень АтТГ у которых оказался менее 80 МЕ/мл (что допускается у здоровых лиц), во 2-ю

• пациенты с уровнем АтТГ 80—240 МЕ/мл, в 3-ю
• 240—1600 МЕ/мл и в 4-ю — с уровнем АтТГ бо­лее 1600 МЕ/мл. Как видно из представленных данных, среди больных ДТЗ более 1/3 не имеют АтТГ. Если же антитела синтезируются, то преиму­щественно в низких и средних концентрациях. В отличие от больных ДТЗ в группе пациентов с АИТ наличие АтТГ отмечено почти у 80%, при этом пре­валируют лица со средним и высоким уровнем ан­тител, т. е. для больных АИТ характерным призна­ком является более высокий уровень АтТГ.

Выявленная нами повышенная способность к спонтанной продукции ФНОа, ИЛ-10 и ИЛ-6, а также возрастание сывороточного уровня ИЛ-10 у обследованных нами пациентов, с одной стороны, свидетельствуют о том, что выработка данных ци­токинов продолжается и на этапе уже развившегося поражения щитовидной железы. С другой стороны, вероятно, установленный таким образом дисбаланс цитокинов противоположно направленного дейст­вия может способствовать дальнейшему развитию аутоиммунной патологии щитовидной железы.

Таблица 3

Уровень АтТГ в сыворотке больных АИТ и ДТЗ

Выводы

1. При аутоиммунных заболеваниях щитовид­ной железы отмечается значительное усиление способности к спонтанной продукции провоспали­тельных цитокинов — ФНОа, ИЛ-10 и ИЛ-6 клет­ками периферической крови, свидетельствующее о предсуществующей клеточной активации. Наряду с этим снижена их способность отвечать на индук­тор in vitro, отражающая потенциальный ответ in vivo на антигенную стимуляцию. Синтез ИЛ-10 по­вышен как при ДТЗ, так и при АИТ.

Более выраженные нарушения цитокинпро- дуцирующей способности клеток периферической крови наряду с более активным образованием АтТГ наблюдаются у больных АИТ.